參考文獻：
   Morquette Barbara., Ju?wik Camille A., Drake Sienna S., Charabati Marc., Zhang Yang., Lécuyer Marc-André., Galloway Dylan A., Dumas Aline., de Faria Junior Omar., Paradis-Isler Nicolas., Bueno Mardja., Rambaldi Isabel., Zandee Stephanie., Moore Craig., Bar-Or Amit., Vallières Luc., Prat Alexandre., Fournier Alyson E., (2019). MicroRNA-223 protects neurons from degeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis., Brain, 08. IF：11.814
導語：
   多發性硬化癥是種影響腦，脊髓和視神經的慢性炎癥，脫髓鞘和神經退行性疾病。神經元損傷是由各種有害因素引發的，這些因素會影響神經元中不同的信號級聯反應；因此，保護神經元的治療方法需要關注能夠針對多個生物過程的藥劑。本文將重點集中在microRNA上，因為單個microRNA可以針對許多功能相關的信使RNA使microRNA成為強大的表觀遺傳調節因子。那么本研究中microRNA究竟是如何調控多發性硬化癥的呢？一起來看看吧！
結果分析：
1、miR-23a-3p，miR-27a-3p，miR-146a-5p和miR-223-3p在EAE和多發性硬化癥中上調
   與對照動物相比，EAE動物的腰部運動神經元中有4種miRNA顯著上調；miR-146a-5p（2倍），miR-27a-3p（5倍），miR-23a-3p（7倍）和miR-223-3p（40倍）（圖1A）。在視網膜神經元miR-146a5p（2倍）中，與癥狀前對照動物相比，miR-27a-3p（7倍）和miR-23a-3p（30倍）顯著上調。 miR-223-3p未受影響（圖1B）。

                                                      圖1 候選miRNA在EAE和多發性硬化中的表達

2、MiR-27a-3p和miR-223-3p具有神經保護作用
   由于作者觀察到miR-27a-3p和miR-223-3p在死后多發性硬化組織的活動性和白質皮損中均上調（圖1D和F）。所以作者接著做進一步驗證，結果發現轉染miR-223-3p和miR-27a-3p的神經元正常生長，并且沒有表現出任何可能與變性相關的軸突腫脹，斷裂或其他跡象（圖2A）。然后作者用PBMC-CM或對照-CM處理的miRNA模擬物轉染皮質神經元，從性引入M27a或M223可以保護皮層神經元免受PBMC-CM依賴性神經突退化（圖2A-C）。

                                     圖2 MiR-27a-3p和miR-223-3p過表達可預防pbc - cm依賴性神經退行性變

   適當抑制miR-23a-3p/miR-27a-3p (I23a/27a)會顯著地抑制神經元突起生長，而不影響細胞死亡，這一觀點與miRNA簇可能保護神經元免于退化一致（圖3A-C）。此外，miR223的缺失也導致離解皮層神經元的神經突生長顯著減少，而不影響細胞死亡（圖3D-F）。為了確定miR-23a / 27a和miR-223功能喪失的神經元對PBMC-CM的敏感性，用PBMC-CM處理了I23a / 27a轉染的神經元和miR223 /神經元。以其自身的基礎生長做對照，I23a / 27a轉染的神經元對PBMC-CM的敏感性不比陰性對照模擬轉染的神經元更強（圖3G）。類似地，來自miR-223 /小鼠的神經元對PBMC-CM的敏感性未改變（圖3H）。這些結果表明，miR-27a-3p或miR-223-3p的過表達可以防止神經元過程喪失，但是單個miRNA的功能喪失不足以進一步使神經元對PBMC依賴性神經突損失敏感。

                                                                                  圖3 MiR-27a-3p和miR-223功能喪失降低了基底神經元的生長，但對PBMC-CM沒有進一步的響應

3 MiR-223過表達挽救了EAE視神經軸突變性
   在整個EAE過程中，視神經可見軸突膨大、卵圓孔和碎裂(圖4A-J)。在RGC顯著死亡前發病時軸突膨大，在發病高峰期達到最大密度，在慢性期基本消退(圖4A-J和M)。RGC密度在疾病高峰期顯著下降，在慢性期繼續下降(圖4N)。通過qPCR驗證miR-223-3p在RGCs和視神經中的過表達(圖4O)。在包含未注射的眼球凸出軸突的對側視神經中，EAE誘導可導致可見的局灶性變性，其特征為軸突腫脹、卵圓孔和疾病高峰時的碎裂(圖4K)。在包含從對照AAV2-NT注射的視網膜突出的軸突的同側視神經中，類似程度的軸突變性是明顯的（圖4K和P），相反的，與未注射的對側眼相比，注射aav2 - mir -223的眼投射出的視神經軸突腫脹明顯減少(圖4 L和P)。

                                                                                                      圖4在EAE模型中，神經元過表達miR-223可以挽救軸突變性
4、MiR-27a-3p和miR-223-3p通過谷氨酸受體信號介導神經保護

                                           圖5 GluR信號的抑制在體外可以防止神經退行性變性
   PANTHER確定了8個明顯過多的由miR-27a-3p和miR-223-3p的靶基因參與的途徑（圖5A）。與各自的對照組相比，兩種藥物對PBMC-CM誘導的神經元突丟失均無顯著影響(圖5B和C)。為了探究是否可以通過阻斷NMDAR來減輕PBMCCM依賴性變性，使用MK-801治療皮質神經元。結果發現，相對于載體對照，MK-801阻止PBMC-CM介導的過程變性（圖5D和E）。GYKI對PBMC-CM的響應的神經保護作用可能通過AMPAR的抑制來介導（圖5F）。
   研究發現MK-801和GYKI都能夠挽救LNA介導的miR-223-3p功能喪失，使生長恢復到對照神經元的生長水平（圖6A-C）。類似地，應用MK-801或GYKI可以拯救miR-23a-3p / 27a-3p損失 - 去除功能（圖6D-F）。為了直接測試谷氨酸信號傳導在miR-223-3p-和miR-27a-3p-依賴性神經保護中的作用，培養神經元10DIV并用谷氨酸處理以誘導興奮性毒性細胞死亡。如預期的，在陰性對照轉染的神經元中用10或20mM谷氨酸處理導致神經元顯著減少（圖6G）。然而，用M27a轉染可顯著防止10mM谷氨酸處理的神經細胞損失，并且M223對神經元的保護濃度可高達20mM谷氨酸（圖6H和1）。這進一步支持兩種miRNA的神經保護作用都是通過抑制谷氨酸信號傳導反應來介導的這一假設。

                                              圖6 MiR-27a-3p和miR-223-3p功能缺失生長缺陷可以通過抑制GluR恢復

   為了進一步支持該假設，作者研究了miR-223-3p和miR-27a-3p靶向GluA2和NR2B30UTR的3’UTR。研究發現miR-223-3p的表達抑制了GluA2和NR2B的熒光素酶活性（圖7A和B）。此外，miR-27a3p模擬物還抑制由GluA2和NR2B30UTR調節的熒光素酶活性（圖7A和B）。還發現用AAV-223轉導的RGC在體內表現出NR2B的下調表達（圖7C）。與AAV-223注射的視網膜中的非轉導組相比，轉導的RGC的視覺檢查顯示NR2B染色的強度降低，而在AAV-NT條件下，轉導的和未轉導的RGC均顯示相似的強度染色（圖7C）。總之，研究結果支持上述模型，其中miR-223-3p和miR-27a-3p下調GluA2和NR2B的表達，從而有助于其神經保護作用。

                                                                                                          圖7 MiR-27a-3p和miR-223-3p靶向谷氨酸受體亞基