近年來，關于m6A的研究也已逐漸成為一個熱門項目。MiR-221/miR-222在多種癌癥研究中均有著不同程度的影響。今年6月，Han J等人在雜志《molecular cancer》上發表了一篇題為“METTL3 promote tumor proliferation of bladder cancer by accelerating pri-miR221/222 maturation in m6A-dependent manner”的高分文章（IF=10.679），結合兩大熱門研究來探討膀胱癌的發展，首次通過調節非編碼核糖核酸的m6A修飾來影響腫瘤形成的綜合，發現METTL3與膀胱癌患者預后不良有關，可以作為膀胱癌的新型預后和治療靶點，為膀胱癌治療提供新的見解。
 

膀胱癌（BCA）已成為美國第五大常見癌癥，2018年估計有81,190例新病例。膀胱癌的發展是一個復雜的過程，由異常的遺傳變化和表觀遺傳異常引起。表觀遺傳異常主要發生在DNA，RNA和組蛋白修飾的許多層面。在RNA水平中，m6A是最常見的甲基化修飾之一。我們都知道METTL3參與RNA生命周期的所有階段。它通過調控關鍵癌基因或腫瘤抑制因子mRNAs中的m6A修飾來影響腫瘤的形成。在膀胱癌中，METTL3可通過AFF4/NF-κB/MYC信號網絡以m6A依賴方式促進膀胱癌的進展。最近，還發現METTL3影響non-coding RNAs (包括miRNAs, lincRNAs和circRNAs)中的m6A修飾。然而，這一機制是否與METTL3誘導的腫瘤增殖有關尚未報道。
研究思路：

結果分析
一、METTL3在膀胱癌和膀胱癌中上調與膀胱癌患者的預后相關
與鄰近組織相比，METTL3在膀胱癌組織中顯著上調（圖1a），結果與TCGA數據庫（https://cancergenome.nih.gov）下載的具有詳細臨床信息的腫瘤樣本的結果一致。METTL3的蛋白質水平與鄰近的正常組織相比，膀胱癌組織也顯著增加（圖1b）。研究者發現METTL3在膀胱癌細胞系中上調，與正常細胞系SV-HUC相比，mRNA和蛋白水平都有上調（圖1c，d）。膀胱癌組織中的IHC分析顯示METTL3的表達與腫瘤組織學分級有關（表1）。組織學分級較高METTL3組的高表達。此外，Kaplan-Meier存活曲線分析顯示，METTL3高表達的膀胱癌患者預后較差，生存時間較短，而METTL3表達較低（圖1f）。

二、在體內和體外試驗中，METTL3的敲減抑制了膀胱癌的增殖
兩種膀胱癌細胞系T24和EJ用敲低慢病毒和對照慢病毒穩定轉染。然后用qRT-PCR和蛋白質印跡確認METTL3的表達。CCK8測定顯示METTL3敲低導致細胞增殖顯著減少（圖2a，b）。菌落形成試驗也表明了這一點敲低METTL3降低了集落形成效率（圖2c，d）。此外，流式細胞術分析顯示，METTL3敲低細胞中G1的百分比增加，S期的百分比降低（圖2e，f）。在異種移植模型中，注射METTL3（shMETTL3）細胞的腫瘤比注射對照細胞（shNC）的腫瘤生長更慢（圖2g，h）。

三、在體內和體外試驗中，METTL3的過度表達促進了膀胱癌的增殖
  CCK8測定表明METTL3的過表達顯著促進細胞生長與oeNC組（圖3a，b）。殖民地形成測定還顯示，在METTL3過表達細胞中集落形成效率增加（圖3c，d）。此外，流式細胞術分析顯示，METTL3過表達細胞中G1期百分比降低，S期百分比增加（圖3e，f）。此外，注射METTL3過表達（oeMETTL3）細胞的腫瘤比在皮下異種移植腫瘤模型中注射對照細胞（oeNC）的腫瘤生長更快（圖3g，h）。

四、METTL3與DGCR8蛋白互作，以m6A依賴性方式調節pri-miR221/222
m6A印跡顯示METTL3敲低顯著降低了m6A水平。相反，在T24和EJ細胞系中，METTL3過表達增加了m6A水平（圖4a）。免疫沉淀實驗表明METTL3可與DGCR8結合，RNase處理減弱了METTL3和DGCR8的結合，表明它們的結合可能部分由miRNA介導（圖4b）。我們還觀察到METTL3過表達細胞中DGCR8結合的miRNA顯著增加（圖4c），證實METTL3可能影響DGCR8與m6A甲基化miRNA的結合。所有這些結果都暗示著METTL3可通過調節DGCR8的識別和結合來影響pri-miRNA的加工膀胱癌中的pri-miRNA。
研究發現只有miR221/222，miR225，miR4485和let-7e在METTL3敲低后在T24中被改變。經研究預測在膀胱癌中的預后數據庫（http://kmplot.com/analysis/）只有miR221/222在膀胱癌中發揮了致癌作用。然后通過調節miRNA221/222在膀胱癌中的表達，發現miR221/222在METTL3敲低細胞中顯著下降并在METTL3過表達細胞中上調（圖4d），pri-miR221/222的累積發生在METTL3敲低細胞中并且在METTL3過表達細胞中降低（圖4e）。相關性分析顯示56個腫瘤組織中METTL3和miR221（r = 0.2928，P <0.01）或miR222（r = 0.2386，P <0.01）的表達呈正相關（圖4f）。此外，研究者發現通過從METTL3過表達細胞免疫沉淀的DGCR8增加了pri-miR221/222結合水平（圖4g）。此外，MeRIP顯示METTL3過表達顯著增加m6A修飾的pri-miR221/222的量（圖4h）。總之，這些結果表明METTL3可以增強DGCR8對pri-miR221/222的識別以及隨后以m6A方式處理成熟miRNA。

五、miR221/222干擾挽救了擴散METTL3誘導膀胱癌細胞凋亡
當我們在METTL3敲低細胞中轉染miR221/222 mimics時，研究者發現miR221/222 mimics可部分增加由METTL3敲低抑制的膀胱癌細胞增殖（圖5a）。因此，miR221/222抑制劑可部分降低METTL3過表達誘導的細胞增殖（圖5b）。集落形成實驗也表明miR221/222 mimics可部分增加膀胱癌細胞。通過敲低METTL3抑制集落形成效率（圖5c，d）。

六、miR221/222靶向PTEN治療膀胱癌
通過mirtarbase數據庫（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw）發現在PTEN mRNA的3'-UTR中存在miR221/222的結合位點。（圖6a）。此外，進行雙熒光素酶報告基因測定克隆野生型3'-UTR序列和PTEN的突變體3'-UTR序列以構建報告質粒和突變載體，發現miR221/222mimics和野生型報告基因質粒的共轉染顯著降低了熒光素酶活性。相反，miR221/222共轉染的mimics和突變質粒之間的熒光素酶活性沒有顯著差異（圖6b）。通過qRT-PCR和蛋白質印跡驗證了PTEN在METTL3敲低或過表達膀胱癌細胞中的表達，結果顯示METTL3敲低細胞中PTEN的表達顯著增加，METTL3過表達中PTEN的表達降低（圖6c，d）。此外，PTEN的表達miR221/222 mimics轉染后減少（圖6e）并且在miR221/222抑制劑轉染后增加進入膀胱癌細胞（圖6f）。
通過突變PTEN的3'-UTR區的結合位點進行熒光素酶報告基因測定和m6A RNA免疫沉淀測定，結果顯示在膀胱癌細胞中野生型和突變質粒之間的熒光素酶活性沒有顯著差異。 MeRIP結果還顯示m6A和IgG沉淀的PTEN沒有顯著差異。總之，這些結果表明METTL3可能不直接調節膀胱癌中的PTEN mRNA。

七、PTEN與膀胱癌組織中的METTL3表達呈負相關
通過qRT-PCR研究了患者組織中METTL3和PTEN的表達。結果顯示PTEN表達與METTL3在膀胱癌中的表達呈負相關（圖7a）。此外，注射METTL3（shMETTL3）的腫瘤中PTEN的mRNA水平顯著高于注射對照（shNC）的腫瘤（圖7b），而注射METTL3過表達細胞的腫瘤中PTEN的mRNA水平（oeMETTL3）顯著低于注射對照細胞（oeNC）的那些（圖7c）。在異種移植模型中觀察到PTEN蛋白水平的相同變化（圖7d，e）。皮下異種移植腫瘤的IHC顯示MET17陽性率顯著降低，并且METTL3敲低組中PTEN陽性率顯著增加（圖7f）。 METTL3過表達組具有相反的結果（圖7g）。總之，研究者發現PTEN與膀胱癌組織中的METTL3表達呈負相關。

結論:
METTL3可能通過與微處理器蛋白DGCR8相互作用并以m6A依賴的方式積極調節pri-miR221/222過程，在膀胱癌中可能具有致癌作用。據我們所知，這是第一個通過調節非編碼核糖核酸的m6A修飾來影響腫瘤形成的綜合研究，這可能為膀胱癌治療提供新的見解。