單細胞測序首次揭示老年Neurogenic Niche的T細胞浸潤
單細胞轉錄組測序技術發展迅速，在各個研究領域尤其是在發育、免疫和腫瘤方面的應用廣泛，相關高水平文章也層出不窮。這里小編給大家分享一篇最近發表在Nature上的一篇關于在神經源龕(neurogenic niche)在衰老過程中運用單細胞測序技術檢測其復雜細胞組成變化的文章(DOI: 10.1038/s41586-019-1362-5)。
在衰老過程中，各類組織的功能衰退是眾所周知的事情。但這個過程中組織內的細胞組成變化卻鮮為人知。作者提出這一問題后，選取了腦室下區（subventricular zone, SVZ） neurogenic niche部位為研究對象。這里是神經形成的地方，而且細胞類型眾多，在衰老過程中功能逐漸衰退。下面是文章的技術路線。
圖1 單細胞測序揭示老年neurogenic niches中細胞組成變化并鑒定增加的T細胞類群
作者首先對3只3個月和3只28-29個月的小鼠該部位進行灌流后取材，流式分選去除破碎細胞后使用10X Genomics Chromium platform進行單細胞測序。他們得到了14,685個高質量的單細胞轉錄組數據。通過t-SNE分析，兩組樣品中一共發現了11種不同的細胞類型（星形膠質細胞、靜息神經干細胞、活化神經干細胞、神經祖細胞、成神經細胞、神經元、少突細胞祖細胞、少突細胞、內皮細胞、周皮細胞、小膠質細胞、巨噬細胞和T細胞）。（圖1 a）通過兩組樣品間比較，作者發現活化神經干細胞和神經祖細胞類群數量在老年組中顯著減少；這與之前報道的結果一致。同時，他們發現T細胞類群基本只在老年組小鼠中出現（圖1 b）。接下來作者對這些增加的T細胞進行深入研究。
作者首先通過CD3的免疫熒光染色檢測了T細胞在該組織中的定位。通過與CD31（內皮細胞）、SOX2（神經干細胞）、Ki-67（增殖細胞）共染發現這些T細胞沒有分布在血管中，而是在腦實質中，并且更靠近神經干細胞（圖1 e）。那么這些T細胞的分子標志是怎樣的呢？流式和測序結果分析發現這些細胞屬于CD3+CD8+CD4? T細胞（圖1 j），而且也表達CD44、Itgal、CD69和IFN-γ等（圖1 i）。為了驗證在人和小鼠中是否有同樣的現象，作者在人腦切片樣品中通過免疫組化檢測了CD3和CD8的表達，發現老年人腦中對應的T細胞也顯著多于年輕人（圖1 l m）。
圖2 單細胞測序和巢式PCR鑒定血液和腦中T細胞的克隆差異
那么腦中出現的T細胞來源于哪呢？是否是因衰老過程中血腦屏障功能減弱而從血液中被動擴散而來呢？作者對老年小鼠血液中的CD8+T細胞和neurogenic niches中的T細胞進行了Smart-seq V4單細胞測序和TCR Nested PCR。結果發現同一老年小鼠血液和腦中的CD8+T細胞類群差異很大（圖2 a），例如neurogenic niches中的T細胞高表達IFN-γ和PD-1（圖2 b）。而TCR-β的序列分析顯示它們多數經克隆擴增而來，但血液和neurogenic niches中T細胞克隆并不相同（圖2 f）。因此作者認為neurogenic niches中的T細胞并不是血液中的T細胞簡單的被動擴散而來，有可能是識別了老年小鼠腦中的某種抗原。
圖3 Neurogenic niche有干擾素信號通路激活
接下來，作者進一步研究了這個T細胞類群對neurogenic niche的影響。有報道檢測了干擾素對大腦發育和neurogenic niche的影響，但仍沒有結果。作者根據單細胞測序結果找出表達IFN-γ受體的細胞類群（星形膠質細胞、靜息神經干細胞、活化神經干細胞、神經祖細胞、內皮細胞和小膠質細胞），發現了在這些細胞類群中IFN-γ通路相關基因的表達量更高（圖3 a），而且在老年組中也顯著高于年輕組（圖3 f g h i）。通過數據分析并實驗驗證，作者找到BST2作為IFN-γ反應的分子標志。通過分選BST2陽性和陰性的細胞分別進行常規轉錄組測序分析發現BST2陽性的細胞富集的信號通路主要是干擾素反應通路，而BST2陰性的細胞富集通路主要與細胞周期相關（圖4 b）。接下來，作者通過T細胞和神經干細胞的共培養驗證了這一調節作用。T細胞處理后的神經干細胞BST2表達量顯著上升，增殖能力也顯著下降（圖4 g h i）。
圖4 T細胞通過IFN-γ信號通路抑制神經干細胞增殖
這是一篇通過單細胞轉錄組測序發現新的細胞類群并深入研究其功能的代表性文章，值得大家學習參考。其中細胞類群檢測采用了10X Genomics Chromium platform的方法，屬于mRNA 3’端測序，商業化體系已非常完善；而另一種Smart-seq V4單細胞測序則是針對全長mRNA。