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lncRNA與癌癥發展聯系大揭秘——UCA1與胃癌

欄目:最新研究動態 發布時間:2019-07-15
UCA1是一種已被發現的lncRNA,研究者們發現它多種癌細胞的遷移、侵襲和耐藥密不可分......

  lncRNA在多種細胞過程中發揮著重要的作用,近年來,關于lncRNA的研究已逐漸成為一個熱門項目。UCA1是一種已被發現的lncRNA,研究者們發現它多種癌細胞的遷移、侵襲和耐藥密不可分。今年7月,Dr. Wang CJ等人在雜志《molecular cancer》上發表了一篇題為“The lncRNA UCA1 promotes proliferation, migration, immune escape and inhibits apoptosis in gastric cancer by sponging anti-tumor miRNAs”的文章,探究了長鏈非編碼RNA UCA1在胃癌發生發展過程中所扮演的角色,揭露了UCA1促進胃癌細胞增殖、遷移、免疫逃逸的機制,為治療胃癌提供了新的思路

摘要:

背景:UCA1是一類長鏈非編碼RNA,在胃癌(GC)等多種人類腫瘤中均被發現存在過表達現象。目前認為UCA1能夠促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲,但UCA1在整個免疫逃逸過程中的作用尚不清楚。

方法:我們收集了40對胃癌和非腫瘤組織樣本。采用原位雜交和qRT-PCR法測定 UCA1在胃癌和對照組織中的表達水平。采用MTT法測定細胞活力。使用transwell法檢測GC細胞的遷移能力。為了了解UCA1在免疫逃逸過程中的作用,野生型或UCA1 KO GC細胞與外周血單核細胞或細胞因子誘導的殺傷細胞在體外共培養。用小鼠模型檢測UCA1在體內的功能。

結果:UCA1促進GC細胞增殖和遷移,并抑制細胞凋亡。UCA1通過直接作用抑制miR-26a/b,miR-193a和miR-214的表達,進而上調PDL1的表達。當與外周血單核細胞(PBMCs)共培養時,UCA1-KO GC細胞可以誘導更高的IFNγ表達,當在體外與細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)共培養時存活率較低。UCA1-KO GC細胞形成較小的腫瘤,miR-26a、- 26b、- 193a和- 214水平較高,異種移植小鼠模型細胞增殖減少,凋亡增加。

結論:UCA1過表達保護PDL1表達不受miRNAs的抑制,促進GC細胞的免疫逃逸。UCA1可作為一種潛在的新型GC治療靶點。UCA1(尿路上皮癌相關1)是一種最早在人類膀胱癌中被發現的lncRNA,在許多其他癌癥中發現其表達上調,參與癌細胞的遷移、侵襲和耐藥。

技術路線:

  研究者的實驗思路大致如下:

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結果:

一、GC患者體內UCA1升高,且與腸型GC患者預后不良有關

  研究者首先利用兩個已發表的芯片GSE54129(111例胃癌患者和21例對照組)和GSE65801(32對胃癌和非癌組織)分析了UCA1在胃癌組織和非癌對照組織中的表達。然后收集了40對胃癌和非癌組織樣本(21例腸型,13例彌漫型,7例混合型),用qRTPCR檢測UCA1水平。為進一步證實UCA1在GC組織中的上調并確定其亞細胞位置,研究者使用原位雜交(ISH)檢測UCA1在 GC和對照組織切片中的表達。最后,研究者分析Dr. Szász AM等人報道的數據(320例腸型GC, 241例彌漫型GC, 32例混合型GC),發現UCA1水平較高的腸型GC患者總體生存率較低,這說明UCA1在胃癌發生過程中具有潛在的致癌作用。

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Fig. 1 在GC組織中發現UCA1調解異常,與預后不良有關。a 用T檢驗對兩個芯片(GSE54129和GSE65801)的UCA1水平進行分析。P < 0.05為差異有統計學意義。 B采用qPCR法檢測40對胃腺癌及相應的鄰近非腫瘤性胃組織的UCA1水平。結果按照Lauren分類顯示,采用單因素方差分析法分析。**p < 0.01。 c 具有代表性的原位雜交圖像顯示UCA1在GC和對照組織中的表達。用圖像J量化UCA1信號的相對密度,用T檢驗確定其顯著性。比例尺,100 μM。 d 采用Kaplan-Meier分析320例腸型GC、241例彌漫型GC和32例混合型GC的生存數據進行分析,p < 0.05為差異有統計學意義

二、UCA1是一類促進胃癌細胞增殖、遷移并抑制凋亡的致癌基因

  為探討UCA1在GC細胞中的生物學功能,研究者構建了UCA1過表達載體,建立了UCA1過表達GC細胞系。同時構建UCA1敲除載體,該載體表達兩個針對UCA1啟動子區域的向導RNA,構建UCA1敲除細胞系。

  研究者利用MTT檢測細胞的存活率,用流失細胞術檢測細胞凋亡,由利用transwell檢測細胞的遷移能力。

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Fig. 2 UCA1是一種onco-lncRNA,能夠促進GC細胞的增殖、遷移并抑制細胞凋亡。a成功建立UCA1過表達GC細胞。b 采用MTT法測定UCA1過表達細胞和對照組GC細胞的存活率。c 原理圖為UCA1敲除載體設計。以UCA1啟動子區為靶點的兩個向導RNA通過一個質粒共表達。d 通過共轉染UCA1-KD載體和Cas9表達載體,成功降低了兩種GC細胞的UCA1水平。e MTT法測定UCA1-KD GC細胞的存活率。f 細胞凋亡檢測。用FITC標記的Annexin V抗體孵育UCA1-KD或對照GC細胞,然后PI染色。流式細胞術測定細胞凋亡率。g和h細胞過夜,消耗血清,用絲裂霉素處理,然后進入Transwell的上腔室。用4%多聚甲醛固定遷移到下腔室的細胞,然后用結晶紫染色。使用倒置顯微鏡,在5個隨機不同視野中對結晶紫染色細胞計數。結果用t檢驗進行分析,p < 0.05為差異有統計學意義。 *p < 0.05, **p < 0.01
三、UCA1與miR-26a/b相互作用,調控EZH2和CDK6的表達。
  近年來的許多報道指出,lncRNA可以對各種miRNA產生“海綿樣”作用,從而抑制由miRNA介導的功能。研究者分析發現miR-26a和-b可以直接與UCA1結合并用雙熒光素酶驗證,除了檢測UCA1在GC細胞中過表達時,內源性miR-26a和-b的表達水平變化外,研究者還檢測了miR-26靶蛋白EZH2和CDK6的蛋白水平,隨后,研究者用qRT-PCR測定體內miR-26a和-b水平。結果證明,UCA1通過海綿作用吸附miR-26a/b以調控EZH2和CDK6的表達。

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Fig. 3 UCA1海綿作用吸附miR-26a/b,從而促進miR-26a/b靶基因的表達。a 預測miR-26a/b與UCA1之間的相互作用。 b 雙熒光素酶檢測。用UCA1 3'UTR報告載體和miR-26a/b模擬物或抑制劑轉染HEK293T細胞。相互作用48小時后檢測相對熒光素酶活性。c和d 過表達UCA1的GC細胞中miR-26a和-b水平受到抑制,miR-26a和-b靶基因表達上調。 e 采用qRTPCR法檢測40對胃癌及相鄰非腫瘤對照標本中miR-26a和-b的水平。通過相關分析,分析UCA1與miR-26a或-b的相關性。

四、UCA1直接與miR-214和miR-193a相互作用

  研究者發現發現miR-214和-193有被UCA1“海綿”吸附的潛力,此前有報道稱此二者均具有抑制腫瘤的功能。研究者采用雙熒光素酶法測定miRNA與UCA1的相互作用。

  PDL1可以與PD-1相互作用,抑制T細胞活化,誘導效應T細胞凋亡,最終削弱抗腫瘤免疫。研究者通過預測發現在PDL1 Mrna的3’UTR上存在miR-214和-193a靶點。隨后研究者采用雙熒光素酶法測定miRNA與PDL1的相互作用。

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Fig. 4 UCA1與miR-193a和miR-214相互作用,然后調節PDL1的表達。a 預測UCA1與miR-193a或miR-214之間的相互作用。b 雙熒光素酶檢測。用UCA1全序列作為螢火蟲熒光素酶3'UTR的報告載體,與HEK293T細胞共轉染,并加入miRNA模擬物或抑制劑。轉染48小時后檢測熒光素酶活性。 c qRT-PCR檢測miR-193a和- 214的相對表達。d 預測PDL1與miR-193a或miR-214之間的相互作用。e 雙熒光素酶檢測。將HEK293T細胞與PDL1 3'UTR報告載體和miR-193a或miR-214的模擬物或抑制劑共轉染48h。檢測熒光素酶活性,用t檢驗分析結果。 f miR-193a和miR-214抑制內源性PDL1表達

五、UCA1通過海綿miR- 214和miR-193a調控PDL1表達

  研究者通過western blot和流式細胞術分析了UCA1敲除后GC細胞中PDL1表達,以確定UCA1敲除是否可以通過海綿miRNA誘導GC細胞中PDL1下調進而減輕T細胞的抑制,同時使用拮抗劑進行挽救,以驗證結論。由實驗結果可以看出,細胞表面PDL1水平受UCA1-miR-193a/214軸調控。

  研究者通過檢測釋放到上清液中的IFNγ水平評估如果調控GC細胞株上PDL1的表達是否可以改變受PHA刺激的健康供體PBMC的活化。

  研究者還分析了在效應靶比為10:1至40:1的范圍內,CIK細胞對AGS和SGC-7901細胞的細胞毒性。

 

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Fig. 5 敲除UCA1可恢復受PHA刺激的T細胞活化,提高CIK治療的細胞毒性。a UCA1-KD GC細胞中總PDL1水平降低。b 流式細胞術檢測細胞表面PDL1。c PHA誘導的PBMCs與UCA1-KD或對照組GC細胞共培養。ELISA檢測上清液中產生的IFNγ。d 降低GC細胞中PDL1的表達可以提高對體外CIK治療的細胞毒性敏感性

六、UCA1調控PDL1表達,調節抗腫瘤免疫反應

  為了探討UCA1敲除在體內腫瘤生長調控中的作用,研究者利用AGS細胞皮下異種移植小鼠模型檢測UCA1的功能。將AGS-NC和AGSUCA1-KO細胞皮下注射到SCID小鼠體內。每7天測一次腫瘤體積,連續28天。

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Fig. 6 UCA1表達的下調抑制了異種移植小鼠模型腫瘤的生長。a 我們利用AGS細胞株研究了UCA1下調對胃癌皮下移植小鼠模型調控的影響。將AGS-NC和AGS-UCA1-KD細胞皮下注射到SCID小鼠體內。每周測量腫瘤體積,連續4周。b 統計分析顯示, PDL1表達下調顯著抑制腫瘤生長。c 28天后,UCA1-KD組腫瘤重量較對照組輕(p < 0.001)。d qRT-PCR結果顯示,UCA1-KD組miR-26a、miR-26b、miR-193a、miR-214水平升高。e 免疫組化結果顯示,UCA1-KD組的PDL1蛋白水平和Ki-67表達均下降。f 免疫印跡結果顯示,UCA1-KD腫瘤中裂解的PARP1和caspase-3表達水平升高

結論:

  UCA1可以通過抑制miR-26a和miR-26a等抗腫瘤miRNA的表達,促進胃癌細胞的增殖遷移,并抑制細胞凋亡;抑制miR-193a和miR-214等miRNA的表達,使PDL1表達上調,從而抑制宿主免疫系統的功能。UCA1-KO GC細胞在體內形成較小的腫瘤,miR-26a、- 26b、- 193a、- 214水平較高,細胞增殖減少,凋亡增加。

  這些研究證明,UCA1與GC的發生發展關系甚密,可以以其為新的切入點, 探究GC治療的新靶點。