順鉑耐藥是晚期頭頸部腫瘤(HNC)的一大挑戰，為攻克晚期頭頸部腫瘤(HNC)的難關，了解順鉑耐藥的潛在機制成為了當務之急。

2019年1月14日，上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院在《Genome Biology》雜志上發表了題為“Exosomal miR-196a derived from cancerassociated fibroblasts confers cisplatin resistance in head and neck cancer through targeting CDKN1B and ING5”的文章，IF=13.21。

這項研究揭示了CAF衍生外泌體miR-196a賦予 HNC順鉑耐藥的原理，并為miR-196a可能作為HNC中順鉑耐藥的預測因子和潛在治療靶點提供了理論基礎。

背景：順鉑耐藥是晚期頭頸部腫瘤(HNC)的一大挑戰。臨床迫切需要了解順鉑耐藥的潛在機制，并制定有效的策略。然而，腫瘤間質如何調控HNC生長和耐藥尚不清楚。

結果：我們發現癌相關成纖維細胞(CAFs)對順鉑具有固有的耐藥性，并通過將將功能外泌體miR-196a從CAFs傳遞到腫瘤細胞，從而在調控HNC細胞的存活和增殖方面發揮積極作用。然后，外泌體miR-196a結合新的靶細胞CDKN1B和ING5，賦予HNC細胞順鉑耐藥性。CAFs損耗的外泌體或外泌體miR-196a功能性地恢復HNC的順鉑敏感性。重要的是，我們發現miR-196a 包裝成CAF衍生外泌體可能是由異質性核核糖核酸蛋白A1 (hnRNPA1)介導的。此外，我們還發現，高水平的血漿外泌體miR-196a在臨床上與較差的總體生存率和化療耐藥性相關。

結論：本研究發現，CAF衍生外泌體miR-196a通過靶向CDKN1B和ING5賦予 HNC順鉑耐藥，這提示我們miR-196a可能作為HNC中順鉑耐藥的預測因子和潛在治療靶點。

研究結果：

Fig. 1 HNC衍生的CAFs對順鉑具有天然的耐藥特性。

a 免疫熒光染色,α-SMA FAP, FSP1 在NFs和CFAs 的表達(比例尺,20μm)。 b 免疫印跡分析α-SMA、FAP和FSP1在六個配對NFs和CAFs的蛋白質含量 。c NFs、CAFs和HNC細胞有無被10μM順鉑治療8天,并且測量細胞生存能力獲得細胞生存和規范化的百分比控制細胞。d NFs、CAFs和HNC細胞有無被10μM 順鉑治療24 h，并且檢測細胞生存能力來計算在順鉑治療下增殖細胞的百分比。e在10μM順鉑治療8天的條件下，存活的CAFs的百分比(CAF3)和有順鉑耐藥性HN4-res細胞,表現出相似的保留擴散率。 f, g蛋白質印記檢測NFs、CAFs、CAL 27、sc -25、HN4、HN4-res細胞中MRP2、ATP7B、CTR1、XIAP、ERCC1、ERCC4、GSTK1、Bcl-2蛋白水平。并對頻帶強度進行評估。(ns, 無顯著性差異; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p<0.001; ****p < 0.0001)

Fig. 2 CAF衍生的外泌體增加HNC細胞增殖和順鉑耐藥。

a分別在CAF -CM和對照CM中培養CAL 27 和 HN4細胞6天，觀察細胞存活率。b分別在CAF -CM和對照CM中培養CAL 27和HN4細胞6天，然后進行MTT檢測這些細胞的順鉑反應。c,在對照CM、ca -CM或外泌體缺失的ca -CM中分別在對照CM、CAF-CM或者外泌體損耗的CAF-CM中培養c27和HN4細胞6天，并檢測細胞存活率。采用MTT法檢測這些細胞對順鉑的耐受性。d, 將HNC細胞與DMSO處理的HNC細胞、DMSO處理的 CAFs或GW4869處理的CAFs共培養6天，然后評估HNC細胞的存活率。采用MTT法測定順鉑治療后共培養HNC細胞的存活率。e采用NanoSight粒子追蹤分析CAFs或順鉑治療的CAFs的粒度分布和數量  f采用NanoSight粒子追蹤分析NFs, CAFs, 和有或沒有接受順鉑(10 μM)治療的 HNC 細胞的數量。 g來自NFs、CAFs,和有或沒有接受順鉑(10μM)治療的HNC細胞中CM的核外蛋白質濃度。 h用來自CAFs的 DiO外泌體示蹤(25 μg/mL)液培育CAL 27和 HN4細胞24 h,并使用共焦顯微鏡(比例尺,20μm)檢測綠色的外泌體信號。 i流式細胞檢測分析按照規定時間在來自CAFs的 DiO外泌體示蹤(25 μg/mL)液中培育的Dio陽性CAL 27 or HN4 cells細胞。 j 用來自HNC細胞, CAFs, 或者順鉑(10 μM)治療的CAFs的外泌體(25 μg/mL) 處理HNC細胞 6天。檢測細胞活力，并進行MTT檢測，以鑒定這些細胞的順鉑反應。k 用來自HNC 細胞，順鉑(10 μM)治療的HN4-res細胞，或者 順鉑治療的(10 μM) CAFs 的外泌體(25 μg/mL) 處理HNC細胞6天。用MTT法測定這些細胞的存活率和存活率。(NT, 沒有順鉑治療; CT, 順鉑治療; ns, 無顯著差異; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p<0.001; ****p < 0.0001)

Fig. 3 miR-196a從CAFs外體轉移到HNC細胞。

a采用real-time PCR技術分析miR-196a在NFs、CAFs、正常口腔上皮細胞(冠名正常)、原發性癌細胞和HNC細胞系中的表達。 b 將CAL27和HN4細胞分別在對照CM、CAF-CM或外泌體損耗的CAF -CM中培育24 h, 使用real-time PCR檢測細胞中miR-196a的表達水平。c 將CAL 27和 HN4細胞與DMSO-處理的HNC 細胞， DMSO處理的CAFs，或者GW4869處理的CAFs共培養24 h,然后使用 real-time PCR檢測miR-196a在HNC細胞中的表達水平。 d 被 Cy3標記的miR-196a (Cy3-miR-196a) 暫時性轉染的CAFs與CAL 27或HN4細胞共培養48 h。用熒光顯微鏡來檢測HNC細胞內的紅色熒光信號(比例尺,20μm)。 e 使用Real-time PCR分析miR-196a在被RNase A (2mg/mL)單獨處理或與Triton X-100 (0.1%) 聯合處理 20分鐘的CAF-CM t內的表達。f Real-time PCR分析miR-196a在來源于CAFs的外泌體、外泌體損耗的CM和整個CM中的表達。g被來源于HNC細胞 (Ctrl Exos)，CAFs， 或者有或沒有被miR-196a模仿 轉染的CAFs 外泌體(25 μg/mL)培育24h后用real-time PCR檢測miR-196a在CAL 27和 HN4細胞內的表達。  h被來源于HNC細胞 (Ctrl Exos) ，CAFs， 或者有或沒有被anti-miR-196a轉染的CAFs 外泌體 (25 μg/mL) 培育24h后用real-time PCR檢測miR-196a在CAL 27和 HN4細胞內的表達。 i, j and the cisplatin response in these cells was determined with MTT assays. 用指定的外泌體(25 μg/mL)處理CAL 27和HN4細胞6天，用MTT檢測這些細胞的順鉑反應。(ns, 無顯著性差異; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p<0.001; ****p < 0.0001)

Fig. 4 hnRNPA1蛋白介導miR-196a包裝成CAF衍生的外泌體。

a 通過RBPDB分析預測miR-196a序列與RBP 基序之間的特異性相互作用(閾值0.7)。 b轉染特異性siRNAs 48 h后，ZRANB2、hnRNPA1和ELAVL1在CAFs中的表達水平的蛋白印記和real-time PCR結果顯示。 c用real-time PCR檢測特定siRNAs 靶向轉染ZRANB2、hnRNPA1或ELAVL1的CAFs外泌體中miR-196a的表達。 d Real-time PCR分析顯示miR-196a在hnRNPA1沉默的CAFs中表達。e蛋白印記對于 hnRNPA1在由細胞核miRNA下調、細胞質、外泌體CAFs裂解物以及生物素化指示的miR-196a或突變miR-196a衍生的樣品中的表達分析；生物素化聚(G)作為陰性對照。 f 用 anti-hnrnpa1抗體(或IgG作為對照)對細胞或體外溶出物進行RIP檢測。real-time PCR檢測免疫沉淀樣品中miR-196a水平，并報告其相對于輸入樣品的百分比(%輸入)。 g RIP法測定經順鉑處理或不經順鉑處理的CAFs細胞質或外體裂解物中miR-196a相對于IgG的hnRNPA1富集。h 在同時被Cy3-miR-196a 和 特定的 siRNAs 靶向hnRNPA1轉染的CAFs 中共培養CAL 27和HN4細胞48 h。用熒光顯微鏡是檢測HNC細胞中的紅色熒光信號(比例尺,10μm)。 i用混合的CAL 27細胞加hnRNPA1、sh-NC或sh-hnRNPA1轉染的CAFs進行裸鼠皮下異種移植，顯示腫瘤生長曲線和腫瘤體積。 j FISH法檢測miR-196a在異種移植瘤中的分布情況，并檢測miR-196a在腫瘤細胞中的表達情況。 k 108對HNC樣本及鄰近正常組織中hnRNPA1 mRNA表達水平。HNC組織中miR-196a表達與hnRNPA1表達的l相關性分析(n = 108) (NT, 未經順鉑治療; CT, 順鉑治療; *p< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001)

Fig. 5 miR-196a通過促進G1/S的過渡和凋亡抗性來調控HNC細胞的增殖和存活。

a miR-196a或anti-miR-196a轉染48 h后，用CAL 27細胞進行細胞增殖檢測。 b miR-196a或anti-miR-196a轉染48 h后，具有代表性的顯微圖和包含edu合并細胞的定量。 c MTT法檢測miR-196a或anti-miR-196a轉染48 h的CAL 27細胞，然后在指定濃度下順鉑處理72 h。 d順鉑(3μM)治療條件下被miR-196a和anti-miR-196a轉染的CAL 27細胞的平板集落形成試驗。 e轉染48 h后，流式細胞儀分析miR-196a或anti-miR-196a轉染的CAL 27細胞的細胞周期分布。f, g在miR-196a和anti-miR-196a轉染的CAL 27細胞轉染48 h后，使用流式細胞術分析順鉑(10μM)誘導的細胞凋亡。(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)

Fig. 6 CDKN1B和ING5是HNC細胞外泌體miR-196a的直接靶細胞。

a基因本體論分析miR-196a預測候選靶基因示意圖。 b miR-196a或anti-miR-196a轉染 48 h后，CDKN1B和ING5 mRNA在CAL 27和HN4細胞中的表達。 c在HNC 細胞 (Ctrl Exos) 和 CAFs分泌.的外泌體 (25 μg/mL)內培育48h后CAL 27 and HN4細胞內的CDKN1B 和ING5 mRNA水平  d, e HNC組織中miR-196a表達與CDKN1B或ING5表達的相關性分析(n = 108)。 f 預測CDKN1B和ING5基因3’UTRs中miR-196a靶序列。g miR-196a和熒光素酶報告基因共轉染293T細胞后，CDKN1B或ING5報告基因的相對活性。h anti-miR-196a 對293T細胞內CDKN1B或ING5報告基因熒光素酶活性的影響。i f CAF衍生外泌體 (25 μg/mL) 對293T細胞內CDKN1B或ING5報告基因熒光素酶活性的影響。j顯示miRNA靶細胞免疫沉淀程序的圖表。 k 靶轉錄本與miR-196a的相互作用。用生物素化的miRNC或miR-196a 轉染CAL 27或HN4細胞48 h。通過real-time PCR和 規范化的β-actin分析 CDKN1B和ING5 mRNA在被biotin-miR-196a下拉的材料中的水平。 l. p27 and ING5 expression in the indicated cells  miR-196a 或 anti-miR-196a轉染，或用CAF衍生外泌體 (25 μg/mL)培育的CAL 27和 HN4細胞24h。用蛋白質印記檢測指定細胞內p27和ING5表達。 m轉染48 h后，被miR-NC, 加上控制向量的 miR-196a r, 加上CDKN1B質粒的miR-196a, 或者加上ING5 質粒miR-196a的轉染的HNC細胞細胞周期和順鉑誘導細胞凋亡分析的結果。(ns, 無顯著性差異; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)

Fig. 7 miR-196a通過下調CDKN1B和ING5，加速HNC細胞對順鉑的耐藥。

a  蛋白質印跡檢測顯示CDKN1B特異性轉染siRNA 48 h后，CAL l27和HN4細胞中p27、p21、CDK2、CDK4、Cyclin D1和Cyclin E1的蛋白水平。 b蛋白質印跡檢測顯示ING5特異性轉染siRNA 48 h后，CAL 27和HN4細胞中ING5、Bcl-2、Bax、全長Caspase 3、裂解的Caspase 3、全長PARP和裂解的PARP的蛋白水平。 c 左圖： transfection with siRNAs specific for CDKN1B or ING5. 蛋白質印跡檢測顯示siRNAs特異性轉染CDKN1B或ING5 48小時后，CAL 27和HN4細胞中p27和ING5的蛋白水平。 右圖：如圖所示，MTT法顯示轉染48小時后CAL 27和HN4細胞順鉑反應。 d 左圖：蛋白質印跡檢測顯示同時轉染miR-196a和外源性表達載體(CDKN1B或ING5) 48 h后，CAL 27和HN4細胞中p27和ING5的蛋白水平。.右圖：如圖所示，轉染48小時后，CAL 27和HN4細胞的順鉑反應。e左圖：蛋白質印跡檢測顯示轉染anti-miR-196a和針對于CDKN1B或ING5的 siRNAs 48 h后，CAL 27和HN4細胞中p27和ING5的蛋白水平。右圖：如圖所示，轉染48小時后，CAL 27和HN4細胞的順鉑反應。f 左圖： 蛋白質印跡檢測顯示轉染miR-196a和外源性表達載體(CDKN1B或CDKN1B 3’UTR) 48 h后，CAL 27和HN4細胞中p27蛋白水平。 右圖： 如圖所示，轉染48小時后，CAL 27和HN4細胞出現順鉑耐藥性。G左圖：蛋白質印跡檢測顯示被miR-196a和外源性表達載體(ING5或ING5 3’UTR) 轉染48 h后，CAL 27和HN4細胞中ING5的蛋白水平。右圖：如圖所示，轉染48小時后，CAL 27和HN4細胞出現順鉑耐藥性。 (ns,無顯著性差異; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)

Fig. 8 CAF 衍生的外泌體miR-196a在體內增強HNC細胞對順鉑的耐藥性

a用有或無CAFs的CAF 27細胞建立異種移植小鼠模型。小鼠腹腔注射順鉑(4mg/kg，每4天注射一次)，加或不加GW4869 (2 mg/kg，每2天注射一次)。顯示腫瘤生長曲線、腫瘤體積和腫瘤重量。 b穩定轉染或不轉染miR-196a的CAL 27細胞，穩定轉染miR-196a或anti-miR-196a的CAFs細胞。裸鼠皮下移植預轉染的CAL 27細胞或CAFs。小鼠腹腔注射順鉑5次(4mg/kg，每4天一次)。顯示腫瘤生長曲線、腫瘤體積和腫瘤重量。 c miR-196a水平上調與HNC組織中腫瘤大小增加、淋巴結轉移和晚期腫瘤分期有關。 d Real-time PCR分析顯示miR-196a在化療敏感患者(n = 20)和化療耐受患者(n = 20)的HNC組織中的表達。 e Kaplan-Meier總體生存分析。與低miR-196a表達的患者相比，高miR-196a表達的患者總體生存率明顯較低。 f 采用real-time PCR技術檢測HNC患者和健康獻血者血漿外體miR-196a水平。 g HNC患者術前和術后匹配血漿中miR-196a的Real-time PCR分析(n = 40)。 h 對化療敏感(n = 20)和化療耐受(n = 20)患者血漿中miR-196a核外表達的Real-time PCR分析。i Kaplan-Meier法分析74例HNC患者的總生存率，根據治療前血漿中miR-196a的外泌體中位水平，分為高miR-196a組和低miR-196a組。 j, 血漿外體miR-196a表達的ROC曲線分析，用于區分化學耐受組(n = 20)和化學敏感組(n = 20)。AUC,曲線下面積。 k一個說明CAF衍生的外泌體miR-196a對HNC細胞增殖和順鉑耐藥的調節作用的模型。 (*p< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p< 0.0001)