即使外泌體能夠包裝長鏈非編碼RNA（lncRNAs）去調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的交流，但是外泌體lncRNA PTENP1在膀胱癌（BC）中的角色還不清楚。鑒于這一點，Jing Qian和Zhengdong Zhang等人帶領(lǐng)他們的團隊，研究了外泌體lncRNA-PTENP1在BC中的角色，并將研究成果于2018年10月3日發(fā)表在了Molecular Cancer雜志（IF=7.76）上。在本次研究中，作者首先檢測了PTENP1在BC和健康對照組的表達，發(fā)現(xiàn)PTENP1發(fā)生在組織和血漿外泌體中。通過ROC和AUC分析，作者評估了PTENP1的診斷準確度。為了決定外泌體PTENP1的功能，作者做了細胞表型和動物實驗。發(fā)現(xiàn)PTENP1在BC病人組織和BC病人來源的血漿外泌體中顯著下調(diào)；作者發(fā)現(xiàn)PTENP1主要被外泌體包裝。外泌體PTENP1在BC病人和健康對照組中不同。正常細胞分泌的外泌體PTENP1，并且能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)運到BC細胞中，因此通過細胞凋亡和降低細胞遷移和侵襲能力抑制BC細胞的惡性行為。在體內(nèi)，外泌體PTENP1能夠抑制腫瘤生長。外泌體PTENP1能夠通過結(jié)合miR-17調(diào)節(jié)PTENP1的表達。因此，作者得出結(jié)論，外泌體PTENP1可以考慮作為BC治療的一個新的biomarker。來源于正常細胞的外泌體能夠?qū)TENP1轉(zhuǎn)運到BC細胞中，能夠在體內(nèi)體外降低BC的緊張。在BC致癌過程中，外泌體PTENP1能夠參與正常細胞到膀胱細胞的交流。

技術(shù)路線

實驗結(jié)果
1. 血漿外泌體lncRNA- PTENP1在膀胱癌中顯著，并且可以考慮作為膀胱癌的biomarker

圖1 血漿外泌體PTENP1在BC病人中的表達。

A. 外泌體的顯微圖片。B. WB檢測外泌體的marker(TSG和CD63)。C. qRT-PCR檢測外泌體PTENP1的表達。E. 在0、4、8、24h的血漿外泌體中PTENP1的表達。F. 外泌體PTENP1反復(fù)凍融0、2、4、8次后檢測外泌體PTENP1的表達。

2. 過表達PTENP1能夠抑制膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲 

圖2 PTENP1在BC細胞表型的效應(yīng)。

EJ和J82細胞中轉(zhuǎn)染PTENP1表達質(zhì)粒或NC載體。A. qRT-PCR檢測PTENP1在mRNA水平上的表達。B. CCK-8實驗檢測細胞的活性。C. 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力。D. transwell實驗檢測EJ和J82細胞的侵襲能力。E. transwell實驗檢測EJ和J82細胞的遷移能力。F.流式細胞術(shù)檢測EJ和J82細胞的凋亡能力。G. 流式細胞術(shù)檢測EJ和J82細胞的細胞周期。

3. 膀胱癌細胞能夠攝取正常細胞分泌的外泌體

圖3 外泌體PTENP1作為細胞內(nèi)交流調(diào)節(jié)器。

外泌體從293A, J82和EJ細胞中分離。A. qRT-PCR檢測加入 RNase (2 μg/ml)和共同加入Triton X-100 (0.1%) 20min后，293A, J82和EJ細胞培養(yǎng)基中PTENP1的表達。B. 293A, J82和EJ細胞培養(yǎng)基中分離的外泌體的顯微圖片。C. WB檢測細胞系中的外泌體的marker（TSG101和CD63）。D. qRT-PCR檢測293A, J82和EJ細胞培養(yǎng)基中外泌體PTENP1的改變倍數(shù)。E. 293A細胞外泌體被PKH67標記后孵育J82和EJ細胞3h。

4. 過表達外泌體PTENP1能夠抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲

圖4 外泌體PTENP1對膀胱癌細胞表型中的影響。

外泌體從轉(zhuǎn)染PTENP1表達質(zhì)粒和NC載體的293A細胞中分離。293A細胞的外泌體分離后孵育EJ和J82細胞24h。A. CCK-8實驗檢測細胞的活性。B. qRT-PCR檢測PTENP1在mRNA水平上的表達。C. 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力。D. transwell實驗檢測EJ和J82細胞的侵襲能力。E. transwell實驗檢測EJ和J82細胞的遷移能力。F.流式細胞術(shù)檢測EJ和J82細胞的凋亡能力。G. 流式細胞術(shù)檢測EJ和J82細胞的細胞周期。

5. 體內(nèi)上調(diào)PTENP1或外泌體PTENP1都能抑制膀胱癌的發(fā)展

圖5 在體內(nèi)過表達PTENP1和外泌體PTENP1對腫瘤的影響。

過表達PTENP1和外泌體PTENP1轉(zhuǎn)染到EJ細胞中，命名為NC、PTENP1 vector。外泌體從轉(zhuǎn)染PTENP1/NC病毒載體的293A細胞中分離，命名為NC-Exos 、PTENP1-Exos。A. 接種NC, PTENP1-Exos, PTENP1 vector和NC-Exos后的裸鼠成瘤實驗。B. 接種NC, PTENP1-Exos, PTENP1 vector和NC-Exos后的異種移植實驗。C. 每兩天檢測腫瘤的體積。D. 每15天檢測終究得中重量。E. qPCR檢測接種NC, PTENP1-Exos, PTENP1 vector和NC-Exos后檢測裸鼠腫瘤中的PTENP1和PTENP的表達。F. HE染色和免疫組化分析ki67和PTENP在腫瘤組織中的表達。

6. PTENP1通過吸附miR-17上調(diào)PTEN的表達

圖6 外泌體PTENP1通過miR-17調(diào)節(jié)PTEN的表達。

A. WB檢測轉(zhuǎn)染PTENP1表達質(zhì)粒和NC載體的EJ和J82細胞中PTEN的表達。B. WB檢測轉(zhuǎn)染外泌體PTENP1和外泌體NC的EJ和J82細胞中PTEN的表達。C. miR-17結(jié)合PTENP的3’-UTR。D. WB檢測轉(zhuǎn)染外泌體PTENP1和miR-17 mimics的EJ和J82細胞中PTEN的表達。

7. 在膀胱癌細胞中，來自于轉(zhuǎn)染PTENP1載體的正常細胞中的外泌體PTENP1能夠提高PTENP1的表達

圖7 外泌體PTENP1調(diào)節(jié)的膀胱癌進展的示意圖。

外泌體PTENP1通過ceRNA機制，吸附miR-17和調(diào)節(jié)PTEN的表達，進一步抑制膀胱癌的進展。