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外泌體瓦解血腦屏障在腦轉移中的作用

欄目:最新研究動態 發布時間:2019-05-22
腦轉移是乳腺癌患者死亡的重要原因之一。腦轉移過程中的一個關鍵事件是癌細胞通過血腦屏障(BBB)的遷移......

腦轉移是乳腺癌患者死亡的重要原因之一。腦轉移過程中的一個關鍵事件是癌細胞通過血腦屏障(BBB)的遷移。然而,通過這一自然屏障的分子機制尚不清楚。

來自日本國家癌癥中心研究所的作者發現,來自癌癥的細胞外囊泡(EVs),通過蛋白質和miRNAs 傳遞的細胞通訊介質,觸發了血腦屏障的崩潰。尤其是,miR-181c通過調控靶基因PDPK1,通過肌動蛋白的異常定位促進BBB的破壞。miR-181c降解PDPK1導致cofilin磷酸化下調,從而激活cofilin誘導的肌動蛋白動力學調節。此外,研究者證明全身注射腦轉移癌細胞來源的EVs促進了乳腺癌細胞系的腦轉移,并優先在體內融入大腦。這些結果表明由EVs介導的一種新的腦轉移機制,可觸發血腦屏障的破壞。

 

主要研究結果:

1.乳腺癌腦轉移細胞系的建立

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圖1 腦轉移乳腺癌細胞系及體外模型的建立。

(a) 腦轉移乳腺癌細胞系制備示意圖 (b)  腦轉移小鼠生物發光圖像(左)。右邊的圖像表示小鼠腫瘤細胞轉移的生物發光圖像。(c)小鼠大腦皮層和中腦HE染色切片的代表性圖像。左上方和下方分別顯示正常小鼠大腦皮層和中腦,未見癌細胞轉移。中間上下面板分別顯示小鼠大腦皮層和中腦,癌細胞轉移。箭頭表示轉移性癌細胞。右上方和下方的面板顯示更高的放大倍數。(d)構建BBB體外模型的示意圖猴腦毛細血管內皮細胞、周細胞和星形膠質細胞的原代培養。(e)共聚焦顯微鏡觀察內皮細胞和周細胞,熒光顯示顯微鏡觀察星形膠質細胞。 (f)免疫熒光顯示緊密連接蛋白(Claudin-5, Occludin和ZO-1)和N-cadherin(紅色) (g) 內皮細胞電阻(transendoelectrical resistance, TEER)來測量腦血管內皮細胞緊密連接的形成,證明血腦屏障的完整性。

 

2.抑制EV分泌抑制通過血腦屏障的侵襲性

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圖2 腦轉移癌細胞的EV被納入內皮細胞,通過癌細胞的BBB調控侵襲。

(a) 透射電子顯微鏡相襯技術觀察重新懸浮的EV球團。 (b)用ImageJ測量pkh67標記EVs的強度。 (c)用PKH67標記從癌細胞中分離出來的EVs,并將其添加到上室。圖示內皮細胞、周細胞和星形膠質細胞。(d)在第4天和第5天從每個細胞系中分離出的EVs添加前(第4天)和后(第5天)監測了TEER的值。從腦轉移癌細胞中分離出來的EVs在體外BBB模型中孵育24小時。 (e)用NaF(分子量376.27)測定血腦屏障通透性。體外血腦屏障模型加入mda - mb -231-lu -D3H1 (D3H1)、D3H2LN、BMD2a或BMD2b細胞和N.C.的EV,24小時后加入NaF。熒光光度計測量通過血腦屏障的NaF。 (f)在體外BBB模型中加入pkh26標記的癌細胞(2104個細胞)。孵育48小時后,清除內皮細胞,用熒光顯微鏡計數入侵細胞。(g) D3H1、D3H2LN、BMD2a或BMD2b細胞體外血腦屏障遷移活性。繪制了相對于D3H1細胞系的遷移細胞數量。(h)為了闡明EVs對腦轉移細胞外滲的貢獻,作者評估了體外BBB模型中,當這些細胞系中的EV分泌 被EV分泌相關蛋白snSMase2 和RAB27B siRNAs 抑制后,BMD2a細胞的外滲。

3.腫瘤細胞來源的ev在體內促進腦轉移

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圖3 癌源性EV促進乳腺癌細胞腦轉移。

(a)注射D3H2LN或BMD2a細胞來源EV的小鼠大腦熒光圖像。上面的圖像代表了老鼠大腦吸收的EVs。下面的圖片代表了老鼠大腦的滲透性。以D3H2LN細胞來源的EV作為對照。這個實驗重復了兩次。(b)光子強度在大腦中的分布,用ImageJ分析量化。(c) D3H2LN和BMD2a細胞源EV和N.C.的生物發光圖像。上圖為小鼠全身生物發光圖像。下面的圖片是患有癌細胞轉移的老鼠大腦的生物發光圖像。(d)小鼠大腦皮質(上板)HE染色的代表性圖像。箭頭表示癌細胞。下圖為抗人波形蛋白(Hu-vimentin)免疫熒光圖像。數據分別代表至少三個獨立實驗(圖d)。

 

4. 細胞間連接的中斷導致血腦屏障的崩潰

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圖4腦轉移癌細胞的EV促進BBB分解。

(a)加入D3H2LN、BMD2a或BMD2b細胞的EV后,緊密連接蛋白(Claudin-5、Occludin和ZO-1)(紅色)和肌動蛋白絲(綠色)的免疫熒光共定位。(b)添加來自D3H2LN、BMD2a或BMD2b細胞的EV后,N-cadherin(紅色)和肌動蛋白絲(綠色)的免疫熒光共定位。(c)緊密連接蛋白、N-cadherin、肌動蛋白和GAPDH的Western blot分析。內皮細胞經陰性對照(N.C.)或EVs處理后的蛋白。這個實驗重復了兩次。數據分別代表至少三個獨立的實驗(圖a,b)。

 

5. EV攜帶的miR-181c減少肌動蛋白絲組織

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圖5 miR-181c在腦轉移患者血清中參與血腦屏障破壞和上調。

(a)熱圖顯示miR-181c在癌源性EV中的表達水平。(b)從D3H2LN、BMD2a和BMD2b細胞中分離得到的ev中miR-181c的含量。 (c)內皮細胞與D3H2LN、BMD2a或BMD2b細胞分離的ev孵育24 h,內皮細胞加入ev后24 h分離RNA, qRT-PCR檢測內皮細胞中miR-181c的表達 (d)內皮細胞加入D3H2LN、BMD2a或BMD2b細胞的ev后,對Claudin-5、Occludin、ZO-1、N-cadherin(紅色)和肌動蛋白絲(綠色)共免疫染色。 這些蛋白定位于mir -181c轉染細胞的細胞質。(e)在轉染miR-181c或對照siRNA前(第4天)和后(第5天)監測TEER值。轉染的miR-181c或N.C. siRNA在體外BBB模型中孵育24小時。 (f)緊密連接蛋白、N-cadherin、肌動蛋白和GAPDH的Western blot分析。 (g)患者血清中miR- 181c含量。

 

6. PDPK1調控的肌動蛋白定位對血腦屏障具有重要意義

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圖6 miR-181c調控腦內皮細胞PDPK1的表達。

(a)芯片分析顯示轉染miR-181c后,PDPK1在內皮細胞中的表達水平。數據表示為log2值。(b)轉染miR-181c后,PDPK1 mRNA在內皮細胞中的表達水平。 (c) PDPK1和GAPDH的Western blot分析。蛋白來源于轉染miR-181c的內皮細胞。下圖為nc . siRNA或miR-181c轉染得到的PDPK1的強度。實驗重復了兩次。(d)芯片分析顯示EV處理后PDPK1在內皮細胞中的表達水平。(e)添加D3H2LN、BMD2a或BMD2b細胞的ev后,PDPK1 mRNA在內皮細胞中的表達水平 (f) PDPK1和GAPDH的Western blot分析。蛋白來自內皮細胞,經D3H2LN、BMD2a或BMD2b細胞的EV處理。

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圖7 內皮細胞中miR-181c, PDPK1的靶點|調控緊密連接蛋白N-cadherin和肌動蛋白的定位。

(a)加入D3H2LN、BMD2a或BMD2b細胞的ev后,緊密連接蛋白(Claudin-5、Occludin和ZO-1)、N-cadherin(紅色)和肌動蛋白絲(綠色)的共免疫熒光。規模的酒吧。(b)緊密連接蛋白、N-cadherin、肌動蛋白和GAPDH的Western blot分析。用PDPK1 siRNA處理的內皮細胞蛋白。 (c) 在PDPK1 siRNA轉染前(第4天)和(第5天)后監測TEER值或陰性對照。(d) 共轉染miR-181c和PDPK1熒光素酶的記者測量熒光素酶活性。 (e) PDPK1、cofilin、phospho-cofilin (P-cofilin)和GAPDH的Western blot分析。蛋白來自D3H2LN、BMD2a或BMD2b細胞的ev處理的內皮細胞。 (f) PDPK1、phospho-cofilin (P-cofilin)、cofilin和GAPDH的Western blot分析。