miRNAs是基因表達的主要調節因子，在癌癥轉移中起關鍵作用。在骨轉移期間，轉移性腫瘤細胞必須重新連接其生物學并表達通常由骨細胞表達的基因（稱為骨擬態過程），其賦予腫瘤細胞在骨髓中充分生長的能力。2018年7月24號，法國國家健康與醫學研究院（INSERM）的研究人員建立了miR-30家族成員miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e作為乳腺癌骨轉移的抑制因子，這些抑制因子調控多種途徑，包括骨擬態。miR-30家族在乳腺癌患者原發性腫瘤中的低表達與無復發生存率相關。另外，雌激素受體（ER）-陰性/孕酮受體（PR）陰性乳腺癌細胞表達的miR-30水平低于其ER/PR陽性細胞。ER/PR陰性乳腺癌細胞中miR-30過表達導致體內骨轉移負荷的減少。在體外，miR-30不影響腫瘤細胞增殖，但確實抑制腫瘤細胞侵襲。此外，miR-30過表達通過逆轉腫瘤細胞條件培養基對破骨細胞生成和成骨細胞生成的作用來恢復骨穩態。一些與破骨細胞生成刺激（IL-8，IL-11），成骨細胞生成抑制（DKK-1），腫瘤細胞骨模擬（RUNX2，CDH11）和侵襲性（CTGF，ITGA5，ITGB3）相關的基因被確定為是miR-30抑制的靶點。在這些基因中，沉默ER-/PR-陰性乳腺癌細胞中的CDH11或ITGA5重現了miR-30對體內骨骼腫瘤負荷的抑制作用?？傮w而言，該研究結果提供了miR-30家族成員采用多種機制來阻止乳腺癌骨轉移的證據，并且可能代表治療干預的潛在靶標。

技術路線：

實驗結果：

圖1：人類MDA-MB-231乳腺癌細胞、MDA-B02成骨細胞和BC-M1乳腺癌細胞的miRNA圖譜分析。

（A）miRNA和乳腺癌細胞系的雙向分層聚類熱圖。miR30家族成員用紅色方框顯示。（B）與MDA-MB-231細胞相比，對MDA-B02和BC-M1細胞中. miR-30-a、-b、-c、-d、-e和.-30-a*、-d*、-e*表達水平的qRT-PCR分析。（C）與MDA-MB-231細胞相比，MDA-B02和BC-M1細胞中Dicer mRNA表達水平的qRT-PCR分析。

圖2：乳腺癌細胞中miR -30s的過表達降低了癌轉移動物的溶骨性病變和骨腫瘤負擔的程度。

（A）腫瘤細胞接種后第32天，裸鼠中具有溶骨性病變(箭頭)的后肢的代表性X線照片。（B）腫瘤細胞接種后第32天攜帶MDA-B02-wt、MDA-B02-p.Vec或MDA-B02-p.30a-b-c-d-e腫瘤的動物的代表性全身生物發光成像。（C）Goldner三色法從腫瘤動物的脛骨干骺端組織切片。（D）TRAP染色的癌轉移骨組織切片。

圖3： miR30s恢復骨穩態。

（A）用M-CSF+RANKL聯合模擬轉染MDA-B02細胞(MDA-B02-Ctrl)或MDA-B02細胞過表達miR-30s(MDA-B02-miR-30s)的小鼠骨髓細胞的體外破骨細胞分化。（B）上圖：用MDA -B02-CTRL或MDA -B02-miR30S細胞對破骨細胞進行RT-qPCR分析。下圖：MTA-B02-CTRL和MDA -B02-miR30S細胞的RTQPCR分析。（C）從MDA-B02-Ctrl或MDA-B02-miR-30s細胞中體外分化成骨MC3T3-E1細胞。骨礦化結節染色采用Von Kossa染色。（D）用MDA B02 CTRL或MDA -B02-miR30S細胞經CM處理的MC3T3-E1細胞的RT-qPCR分析。（E）在成骨條件下培養的MC3T3-E1細胞的體外分化，然后未經處理或用miR-30s模擬物轉染。（F）用MDA -B02-CTRL或MDA -B02-miR30S細胞處理的MC3T3-E1細胞的RT-qPCR分析。

圖4 ：miR30s減少體內乳腺癌的生長和體外腫瘤細胞的侵襲。

（A）在雌性裸鼠皮下接種MDA－B02-pmiRVer（對照）和MDA－B02-pmiR30b-d細胞。（B,C）CD31和Ki-67免疫染色法分別檢測接種MDA-B02-pmiRVec和MDA-B02-pmiR-30b-d細胞小鼠腫瘤組織切片，以測定腫瘤相關血管數量和腫瘤細胞增殖指數。（D）MTA-B02-pmiRVer和MDA－B02-pmiR30b-d細胞在細胞培養后作為時間函數的計數。（E）用miRNA模擬物或干擾物轉染MDA-B02細胞。（F）將MDA-B02-pmiRVec、MDA-B02-pmiR-30b-d、MDA-B02-pmiR-30b-c和MDA-B02-pmiR-30abcde細胞用涂有基底膜基質的多孔膜加載到插入物中， 37℃孵育24h后，取出未侵襲的細胞，固定并染色，顯微鏡下計數。（G）與（F）中相同，用miR-30s的不同基因組序列轉導MDA-B02細胞，并用其對應的antagomiR-30s或scramble antagomiR(陰性對照)處理。（H）與miR-30模擬轉染的MDA-B02和BC-M1細胞干擾物轉染的MDA-B02和BC-M1細胞（陰性對照）。

圖5：Cadherin-11（CDH11）是miR-30s抑制的直接靶點。

（A）與親代MDA-MB-231細胞相比，用miR-30s的不同基因組序列轉導的MDA-B02細胞中CDH11和α-微管蛋白的蛋白質印跡。（B）過表達miR-30s HEK-293T細胞中的相對熒光素酶活性。（C）沉默CDH11后CDH11和?-微管蛋白在親本的DAD-B02細胞和MDA -B02細胞中的Western印跡（D）MDA-B02和MDA -B02-SH-CDH11細胞與MC3T3-E1成骨細胞相互作用。（E）CDA11在MTA-B02中的沉默降低了體內骨轉移的負擔。

圖6：整合素α5（ITGA5）是miR-30s抑制的直接靶點。

（A）表達miR-30s模擬物（ITGA5-wtmiR30s，ITGA5-mut-miR-30s）或與psiCheck2-ITGA5報告載體共轉染的干擾物（ITGA5-wt-Scrbl）的HEK-293T細胞中的相對熒光素酶活性野生型（ITGA5 WT SCRBL，ITGA5-WT-miR30S）或突變（ITGA5-MUT-MI30S）結合位點。（B）用陰性對照干擾物(Ctrl)或miR-30s模擬物(miR-30s)轉染MDA-B02和BC-M1細胞后，ITGA5和?-微管蛋白的蛋白印跡。（C）免疫印跡法檢測ITGA5在模擬轉導(Scrbl)和ITGA5沉默的Hs-578T乳腺癌細胞(ITGA5沉默)中的表達。（D）左圖：動物在動脈內接種表達Hs-578T細胞的熒光素酶后第7天的全身生物發光成像，這些細胞先前被模擬轉導或沉默以表達ITGA5。右圖：顯示各組動物轉移率的圖表。（E）通過多個miR30調控網絡抑制骨轉移。MiR-30s抑制與骨擬態、侵襲和骨破壞相關的基因，從而抑制骨轉移形成。