間充質干細胞（MSC）衍生的外泌體已被認為是各種疾病無細胞治療的新候選者。然而，保持移植后體內外泌體隨時間的保留率和穩定性是MSC衍生的外泌體在床應用中的主要挑戰。一篇發表在《ACS Applied Materials & Interfaces》（IF=8.097）上名為《Enhanced Therapeutic Effects of MSC-derived Exosomes with an Injectable Hydrogel for Hindlimb Ischemia Treatment》的文章研究了人胎盤來源的MSCs（hP-MSCs）衍生的外泌體與殼聚糖水凝膠結合是否可以提高外泌體的保留率和穩定性，并進一步增強其治療效果。研究結果表明，通過Gaussia熒光素酶成像證實了殼聚糖水凝膠顯著提高了外泌體中蛋白質和microRNA的穩定性，并且增大了外泌體在體內的保留率。此外，該項研究評估了水凝膠摻入的外泌體體外的內皮保護和促血管生成能力，同時評估了水凝膠摻入的外泌體在后肢缺血小鼠模型中的治療功能。數據表明，殼聚糖水凝膠可以增強外泌體的保留率和穩定性，并進一步增強后肢缺血的治療效果。本研究中使用的策略可能有助于開發簡單有效的方法來評估和增強干細胞衍生的外泌體的治療效果。

技術路線

結果
1. 外泌體的表征和生物發光報告系統的構建

圖1. 外泌體的特征和生物發光報告標記。

（A）外泌體的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。比例尺，100 nm。（B）外泌體和hP-MSC中CD9，Alix和GM130的Western雜交分析。（C）通過動態光散射測量外泌體的大小分布。（D）生物發光報告質粒表達Gluc-乳粘素融合蛋白的示意圖。（E）隨外泌體濃度增加Gluc (Gaussia luciferase)標記的外泌體的體外成像顯示出增強的生物發光信號（R2=0.9892）。（F）用生物發光成像（BLI）分析在不同時間點HUVEC對Gluc標記的外泌體的內化。

2. 熱敏性水凝膠的表征及其對外泌體的釋放

圖2. 熱敏性殼聚糖水凝膠和殼聚糖水凝膠摻入的外泌體的表征。

（A）殼聚糖溶液（I）和水凝膠（II）的光學圖像。（B）殼聚糖水凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。（C）通過流變學測量分析殼聚糖水凝膠隨溫度變化的流變性質。（D）使用BLI分析Gluc信號檢測CS-Exo外泌體的持續釋放。（E）通過Gluc信號的定量分析檢測釋放的外泌體。信號強度以photons/s/cm2/steradian (sr)表示。（F）在浸入PBS 12 h內外泌體在CS-Exo中的保留率（R2=0.8672）。（G）通過BLI圖像和Gluc信號定量評估從CS-Exo釋放的外泌體的內化。信號強度以photons/s/cm2/steradian (sr)表示。所有實驗均在三個獨立實驗中進行，數據顯示為平均值±SEM。

3. 殼聚糖水凝膠增強了外泌體的保留和穩定性

圖3. 殼聚糖水凝膠增強了外泌體的穩定性和保留率。

（A）通過BLI分析追蹤Gluc信號體內監測移植的CS-Exo或Exo的保留率。（B）Gluc信號的定量分析圖3A中外泌體的保留率。信號強度以photons/s/cm2/steradian (sr)表示。（C）通過real-time qPCR分析評估CS-Exo或Exo中miR-126在37℃下的穩定性。相對基因表達標準化為U6，并通過2-ΔΔCt方法分析數據。（D）通過Gluc信號評估CS-Exo或Exo中蛋白質在37℃下的穩定性。Gluc信號定量分析顯示CS-Exo中蛋白質的穩定性優于Exo中的蛋白質。信號強度以photons/s/cm2/steradian (sr)表示。所有數據均代表三次獨立實驗，并表示為平均值±SEM。（n=3；*P<0.05；**P<0.01，相對于Exo）。

4. CS-Exo在體外發揮增殖和抗凋亡的作用

圖4. CS-Exo在體外發揮增殖和抗凋亡的作用。

（A）HUVEC的增殖受外泌體濃度梯度的影響。（B）在H2O2誘導應激攻擊下，不同濃度的外泌體中HUVEC的存活率。（C）用100 μg/ml外泌體或CS-Exo孵育24小時的后HUVEC（GFP，綠色）增殖（Ki-67，紅色）的典型圖像。比例尺，100 μm。（D）由外泌體或CSExo進行的HUVEC增殖指數的定量分析。（E）在H2O2誘導的應激下外泌體和CS-Exo進行的HUVEC凋亡指數的定量分析。（F）Hoechst 33342染色顯示HUVEC在暴露于400 μM H2O2后施用100 μg/ml外泌體或CS-Exo的存活率。比例尺，200 μm。所有數據均代表三次獨立實驗，并顯示為平均值±SEM。（n=3；*P<0.05；**P <0.01，相對于PBS；#P <0.05，相對于Exo）。

5. 殼聚糖水凝膠改善了外泌體促進血管生成能力

圖5. CS-Exo改善了HUVEC的血管生成能力。

（A）用100 μg/ml外泌體或CS-Exo處理0和24小時的HUVEC的劃痕傷口愈合測定。比例尺，200 μm。（B）各組HUVEC的遷移率統計。（C）用100 μg/ml外泌體或CS-Exo處理12 h的HUVEC的管形成測定的典型圖像。比例尺，200 μm。（D）每組100×視野下的3個隨機區域中的節點數量的定量分析。（E）用100 μg/ml外泌體或CS-Exo處理24 h后HUVEC中的促血管生成基因的real-time qPCR分析。相關基因表達以GAPDH標準化，并通過2-WWCt方法分析數據。所有實驗均在三個獨立實驗中進行，并顯示為平均值±SEM。（n=3；*P<0.05；**P<0.01，相對于PBS；#P<0.05，相對于Exo）。

6. 摻入外泌體的殼聚糖水凝膠增加了缺血后肢的血管生成

圖6. 殼聚糖水凝膠的應用增強了外泌體在缺血部位的促血管生成作用。

（A）在小鼠后肢缺血模型中通過BLI追蹤Vegfr2-luc表達體內監測CS-Exo或Exo移植后血管生成的狀態。信號強度以photons/s/cm2/steradian (sr)表示。（B）通過Fluc信號定量分析缺血后肢血管生成的動態趨勢。（C）在第14天肌肉切片CD31（紅色）染色的典型圖像。細胞核用DAPI復染。比例尺，50 μm。（D）每組中缺血肢體毛細血管密度的定量分析。數據表示為平均值±SEM。（n=5；*P<0.05；**P<0.01，相對于PBS；#P <0.05，相對于Exo）。

7. 聚糖水凝膠摻入外泌體改善了缺血后肢的功能

圖7. CS-Exo的治療加速缺血性肌肉的恢復。

（A）每組中保肢，足部壞死和肢體損失的百分比（n=10）。（B）各組缺血后肢動態損傷和缺血性損傷的半定量臨床評估（n=10）。（C）肌肉切片第14天H&E染色和第28天Masson's trichrome染色的典型圖像（n=5）。比例尺，100 μm。（D）Masson's trichrome染色切片中纖維化面積的定量分析。（E）hP-MSC衍生的外泌體與CS水凝膠結合用于肌肉再生的示意圖。數據表示為平均值±SEM。（*P<0.05；**P<0.01，相對于PBS；#P <0.05，相對于Exo）。