雄激素受體（AR）正在成為三陰性乳腺癌（TNBC）中一種新的預后生物標志物，但潛在的機制尚不清楚。近日發表在《Cell Death & Differentiation》(IF=8.0)的文章《An androgen receptor negatively induced long non-coding RNA ARNILA binding to miR-204 promotes the invasion and metastasis of triple-negative breast cancer》探究了這一機制。由于越來越多的證據表明長鏈非編碼RNA（lncRNA）調節重要的癌癥標志物，故假設AR調節的lncRNA可能在TNBC進展中發揮作用。在三種TNBC細胞系（MDA-MB-231、Hs578T和MDA-MB-436）中進行了雙氫睪酮（DHT）處理或不處理的實驗，鑒定了AR陰性誘導的lncRNA（ARNILA），其與TNBC患者的無進展生存期（poor progression-free survival PFS）相關并促進上皮-間質轉化（EMT）、體內外侵襲和轉移。隨后，證明了ARNILA作為miR-204的競爭性內源RNA（ceRNA）起促進其靶基因Sox4的表達的作用，已知該靶基因可誘導EMT并促進乳腺癌發展，從而促進TNBC的ENT、侵襲和轉移。這項研究結果不僅為lncRNA調節AR的機制提供了新的見解，而且還提出ARNILA作為抑制TNBC患者轉移的替代治療靶點。

技術路線

結果

1. AR的陽性表達與TNBC較好的預后相關。

圖1 TNBC中的AR表達和與存活的關系

a 88例TNBC患者AR表達水平與PFS（logrank檢驗）的相關性。b 來自Kaplan.Meier Plotter（http：//www.kmplot.com / analysis /）的基底樣乳腺癌中RFS與AR表達水平之間的相關性（logrank測試）。c AR陽性組與AR陰性組PFS風險比的森林圖。d 來自TCGA數據庫的AR mRNA水平，包括14個TNBC腫瘤和與其成對的正常組織。

2. AR陰性誘導的lncRNA（ARNILA）的鑒定。

圖2 ARNILA的鑒定

a 用或不用DHT處理的MDA-MB-231，Hs578T和MDA-MB-436細胞的lncRNA微陣列數據的熱圖展示（差異倍數≥2.0，P <0.05）。b 通過用或不用DHT處理的MDA-MB-231，Hs578T和MDA-MB-436細胞的qRT-PCR測定ARNILA的表達。c FISH圖像顯示ARNILA在MDA-MB-231和Hs578T細胞的定位。d 上：TNBC患者的石蠟包埋組織中ARNILA和AR的典型FISH圖像。下：88例TNBC患者中ARNILA和AR表達的關系。e 88例TNBC患者中ARNILA表達水平與PFS的相關性（對數秩檢驗）。f 上：ANRILA啟動子內的引物對位置。下：在MDA-MB-231和Hs578T細胞中ARNILA啟動子上AR豐度的ChIP測定。陽性和陰性對照分別表示為input和IgG。結果表示為平均值±SD。* P <0.05，** P <0.01。

3. ARNILA作為miR-204的ceRNA起到促進Sox4表達的作用。

圖3 ARNILA通過結合miR-204上調Sox4

a 根據miRanda軟件預測的最大分數得出的結合ARNILA的前十個預測的miRNA。根據Kaplan-Meier法推測的未治療TNBC患者中miRNA表達和OS之間的關系（對數秩檢驗）。b 根據Kaplan-Meier法推測的TNBC患者AR表達水平與OS之間的關系（對數秩檢驗）。根據自動選擇最佳截止值將患者分為低和高AR表達。c 左：miRanda軟件推測的ARNILA 3'UTR中的miR-204 MRE。種子序列以粗體表示，突變體序列以紅色表示。右：轉染特定的miRNA類似物后293T細胞中ARNILA-Wt和ARNILA-Mut的熒光素酶活性。數據表示為海腎熒光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性之比。d 左：由TargetScan數據庫推測的Sox4的3'UTR中的miR-204 MRE。種子序列以粗體表示，突變體序列以紅色表示。右：轉染特定的miRNA類似物后293T細胞中Sox4-Wt和Sox4-Mut的熒光素酶活性。數據表示為海腎熒光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性之比。e，f 左：miR-204類似物（e）或抑制劑（f）轉染后MDA-MB-231和Hs578T細胞中Sox4表達的WB分析。右：左圖中顯示的蛋白質水平的量化。g 上：特定質粒轉染后MDA-MB-231和Hs578T細胞中Sox4表達的WB分析。下：上圖中顯示的蛋白質水平的定量。h 上：特定質粒轉染后Hs578T細胞中Sox4表達的WB分析。下：上圖中顯示的蛋白質水平的定量。結果表示為平均值±SD。* P <0.05。NS表示無顯著性差異。

4. Sox4與AR呈負相關，并預測TNBC的臨床結果不佳。

圖4 Sox4與AR和高生存率呈負相關

a 左：特定處理后MDA-MB-231和Hs578T細胞中AR和Sox4表達的WB分析。中間和右側：左圖中顯示的蛋白質水平的量化。結果表示為平均值±SD。* P <0.05。b 151例TNBC患者TCGA數據庫中AR和Sox4的表達。c 根據Kaplan-Meier法推測的TNBC患者Sox4表達水平與RFS之間的關系（對數秩檢驗）。d 上：TNBC患者石蠟包埋組織中AR和Sox4的典型IHC圖像。下：88例TNBC患者中AR和Sox4表達的相關性。e 88例TNBC患者的Sox4水平與PFS之間的關系（對數秩檢驗）。f 88例TNBC患者AR-Sox4結合水平與PFS的關系（對數秩檢驗）。

5. ARNILA在體外促進遷移，侵襲和EMT。

圖5 ARNILA促進體外遷移，侵襲和EMT

a 上：特定的轉染后MDA-MB-231和Hs578T細胞的創傷修復檢測。下：上圖中細胞傷口愈合的量化。b 上：特定的轉染后的MDA-MB-231和Hs578T細胞的穿膜實驗。下：膜下方遷移細胞的定量。c 左：特定處理后，MDA-MB-231和Hs578T細胞中E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白表達的WB分析。中間和右側：左圖中顯示的蛋白質水平的量化。結果表示為平均值±SD。* P <0.05。

6. Sox4負責ARNILA介導的體外遷移，侵襲和EMT。

圖6 Sox4負責ARNILA介導的體外遷移，侵襲和EMT

a 左：特定的轉染后MDA-MB-231和Hs578T細胞的創傷修復檢測。右：左圖中細胞傷口愈合的量化。b 下：特定轉染后的MDA-MB-231和Hs578T細胞的穿膜實驗。上：下圖中細胞遷移的量化。c 左：特定處理后，MDA-MB-231和Hs578T細胞中E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白表達的WB分析。右：左圖中顯示的蛋白質水平的量化。結果表示為平均值±SD。* P <0.05。NS表示無顯著性差異。

7. ARNILA促進體內乳腺癌轉移。

圖7 ARNILA促進體內轉移

a 注射18F-FDG 1小時后小鼠的典型PET/CT圖像。肺和肝轉移用白色箭頭表示。b 兩組肺和肝轉移的發生率（Fisher's exact t檢驗）。c 分離的肺部明視野成像（上圖）和蘇木精和伊紅染色（中部和下部）的肺和肝臟中轉移性囊腫的典型圖像。用黑色箭頭表示肺和肝轉移。d TNBC中基于ARNILA的信號傳輸路線示意圖。在AR-positive TNBC（左）中，AR通過作為轉錄抑制因子顯著抑制ARNILA；因此，ARNILA的海綿狀功能由于其低表達水平而在這里很弱，并且miR-204被釋放以抑制Sox4。在AR-negative TNBC（右）中，由于AR的抑制減少，miR-204主要由ARNILA消耗，因此Sox4以高水平表達。