miR-134在惡性腫瘤轉化中的功能作用是復雜且有爭議的。7月4日，中國臺灣國立陽明大學的學者在 International Journal of Cancer（IF= 7.360）雜志發表了題為“miR-134 targets PDCD7 to reduce E-cadherin expression and enhance oral cancer progression”的論文，該論文闡明了miR-134在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）中的致癌作用。使用野生型和突變體構建體的報告分析證實，程序性細胞死亡7（PDCD7）基因是miR-134的潛在靶標。外源表達miR-134降低OSCC細胞中PDCD7表達，外源性表達miRZip-134增加OSCC細胞中PDCD7的表達；另外，PDCD7表達抑制了OSCC細胞的致癌性。通過基因編輯技術敲除PDCD7增加了裸鼠體外致癌性和頸部淋巴結轉移，并降低了E-鈣粘蛋白（E-cad）的表達。PDCD7通過啟動子中的GC盒反式激活E-cad表達。此外，PDCD7減弱了miR-134相關的細胞轉化和E-cad下調。在OSCC腫瘤組織中觀察到PDCD7和E-cad的下調和高水平的miR-134表達。miR-134-PDCD7-E-cad 發病機制級聯的激活發生在人和小鼠口腔癌變的早期階段。總之，miR-134在口腔癌中的致癌作用是通過降低PDCD7和E-cad的表達來介導的。

技術路線：

研究結果：

1. miR-134在OSCC細胞中以PDCD7為靶點

圖1. miR-134在OSCC細胞中靶向PDCD7。（a）外源miR-134在OSCC細胞亞克隆中表達。（b，c）外源miR-134穩定表達增加了OSCC細胞的生長和遷移。（d，e）外源miR-134瞬時表達增加了BrdU標記的細胞群和OSCC細胞的侵襲。（f，g）外源miRZip-134表達抑制OECM1細胞的增殖和遷移。（h，i）miR-134對PDCD7的3'UTR的作用導致WtR細胞中PDCD7活性降低; 然而，PDCD7活性在MutR的細胞中恢復。（j）外源miR-134表達降低OSCC細胞中的PDCD7表達，而miRZip-134表達增加OECM1細胞中的PDCD7表達。（k）OSCC細胞系中miR-134，PDCD7和E-cad表達的分析。（l）Heatmap blot，OSCC細胞系中miR-134，PDCD7和E-cad表達之間的相關性。

2. PDCD7抑制OSCC細胞的增殖和遷移，miR-134- PDCD7調控E-cad表達

圖2. miR-134下調OSCC細胞中PDCD7和E-cad的表達。（a）外源表達PDCD7抑制OECM1細胞的生長（上圖），BrdU標記的細胞群（中圖）和遷移（下圖）。（b，c）左圖，細胞生長測定;右圖，遷移試驗。（d-g）WB分析。（h）免疫熒光。（b，h）OECM1細胞;（c）FaDu細胞;（d，e）OECM1和FaDu細胞;（f，g）OECM1和SAS細胞。（b）外源性PDCD7在對照和表達miR-134的OECM1細胞中的表達。（c）外源性PDCD7在對照和表達miR-134的FaDu細胞中的表達。（d）外源miR-134表達降低OSCC細胞中的PDCD7和E-cad表達。（e）miR-134抑制劑處理時增加OSCC細胞中的PDCD7和E-cad表達。miR-134調節的β-連環蛋白和波形蛋白的變化不一致。（f）外源性PDCD7表達增加OSCC細胞中的E-cad表達。（g）外源性PDCD7表達可恢復mi-134介導的對E-cad的抑制。（h）OECM1細胞主要在細胞核中觀察到內源性和外源性PDCD7免疫熒光。

3.敲除PDCD7增加OSCC細胞的遷移并減少E-cad表達

圖3. 敲除PDCD7增加了OSCC細胞致癌表型并降低E-cad表達。對OECM1細胞和SAS細胞及其敲除PDCD7細胞亞克隆進行分析。（a，c）OECM1細胞;（b，d，e）SAS細胞;（f - h）OECM1和SAS細胞。（a，b）上圖，細胞生長測定;下圖，典型的倒置顯微鏡圖像。（c，d）上圖，遷移試驗;下圖，在transwell膜下表面使用DAPI標記的細胞核的代表性圖像。DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二鹽酸鹽。（e）侵襲試驗。對SAS細胞及其敲除PDCD7的細胞亞克隆進行分析。（f）qRT-PCR分析以檢測E-cad的mRNA表達。（g，h）蛋白質印跡分析。敲除PDCD7后E-cad和活性β-連環蛋白表達降低；外源表達PDCD7后E-cad表達增加。除了SPDCD7 CR 2-4之外，所有細胞亞克隆中均觀察到外源表達PDCD7后β-連環蛋白的表達增加。

4. PDCD7通過調控GC-Box增加E-cad啟動子活性

圖4.E-cad啟動子報告基因測定和ChIP測定。（a-d）野生型E-cad啟動子報告基因測定。（e）E-cad啟動子中缺失報告基因構建體的示意圖。（f）檢測缺失構建體。（a，b，d - h）OECM1細胞。（c）FaDu細胞。（a，f）外源性表達PDCD7。（b）表達miR-134。（c）抑制miR-134。（d）敲除PDCD7。（g，h）ChIP測定。（g）PCR產物的凝膠電泳圖像。（h）ChIP qPCR分析。

5. miR-134-PDCD7-E-cad在小鼠口腔癌中的激活

圖5. miR-134-PDCD7-E-cad致癌軸在小鼠化學致癌模型和原位頸部轉移模型中的調節。（a - d，f）4NQO誘導的小鼠舌腫瘤發生模型。（g -i）NOD-SCID小鼠的原位頸部轉移模型。（a）與未處理的對照組織相比，癌前病變（16周）和腫瘤病變（28周）中的miR-134染色和PDCD7和E-cad免疫反應性。對照組織，×100;病變組織，×200。（b-d）miR-134，PDCD7和E-cad定量分析。（e）在各種OSCC細胞系中，用4NQO處理均增加miR-134表達。（F）Heatmap blot表明小鼠口腔組織中miR-134，PDCD7和E-cad之間表達的相關性。（g）來自SAS細胞或SPDCD7 CR2-2細胞亞克隆的舌癌和頸部淋巴結病變原發腫瘤的典型病理組織學切片。虛線環繞頸部轉移病灶。（h，i）腫瘤體積的定量（左圖）和轉移率（右圖）。（h）所有腫瘤。（i）腫瘤大小< 10 mm³。

6. miR-134-PDCD7-E-cad在人類OSCC中的激活

圖6. miR-134-PDCD7-E-cad在人類OPMD和OSCC組織中的狀態。（a，b）OPMD。 （c - g）OSCC。（a，c）miR-134染色和PDCD7和E-cad在OPMD和OSCC組織陣列中的免疫反應性。上圖，病變表現出強miR-134染色和相對較低的PDCD7和ECAD免疫反應;下圖，病變表現出弱miR-134染色和相對較高的PDCD7和E-cad免疫反應。OPMD，× 200; OSCC，× 100。（b）左圖，miR-134，PDCD7和E-cad定量分析。中圖，heatmap blot表明OPMD中miR-134，PDCD7和E-cad表達之間的相關性。右圖，PDCD7與E-cad表達的相關性分析。（d）OSCC組織陣列中miR-134，PDCD7和E-cad評分前后圖。（e）左圖和（f）heatmap blot分別說明OSCC組織陣列中miR134/PDCD7/E-cad表達之間的相關性，以及miR134/PDCD7/E-CAD/WWOX在組織對中的表達。（e）右圖，組織陣列中PDCD7和E-cad表達之間的相關性分析。（g）總生存期（左圖）和無病生存期（右圖）。比較具有高miR-134表達水平和低PDCD7或E-cad表達水平的OSCC腫瘤，以及具有相反表達譜的腫瘤。OS，整生存期；DFS，無病生存期。

結論：

該研究闡明了在口腔癌中miR-134靶向PDCD7以驅動致癌性，并且PDCD7反式激活E-鈣粘蛋白表達。在小鼠模型中，PDCD7的敲除增加了口腔癌異種移植物的淋巴結轉移。 miR-134-PDCD7-E-cad調節軸的激活發生在口腔癌發生的早期階段。 這項工作顯示miR-134抑制和PDCD7誘導對口腔癌消除的潛力。

參考文獻：Shih-Yuan Peng , Hsi-Feng Tu, Cheng-Chieh Yang, Cheng-Hsien Wu,Chung-Ji Liu,Kuo-Wei Chang , Shu-Chun Lin. miR-134 targets PDCD7 to reduce E-cadherin expression and enhance oral cancer progression. International Journal of Cancer. 2018 Jul