脂肪細胞衍生的外泌體miR-27a通過抑制PPARγ在骨骼肌中誘導胰島素抵抗
Theranostics: 脂肪細胞衍生的外泌體miR-27a通過抑制PPARγ在骨骼肌中誘導胰島素抵抗
脂肪細胞衍生的內分泌因素促進骨骼肌胰島素抵抗的機制尚未完全了解。miR-27a在前驅糖尿病和T2DM肥胖患者的血清中高度表達，主要由脂肪組織衍生。因此，由脂肪組織分泌到循環中的miR-27a可以調節骨骼肌中的胰島素抵抗。近日，發表在《Theranostics》（IF:8.766）的文章《Adipocyte-Derived Exosomal MiR-27a Induces Insulin Resistance in Skeletal Muscle Through Repression of PPARγ》探究了在肥胖幼年高脂飲食誘導的miR-27a敲減肥胖小鼠，db/db小鼠和過表達miR-27a的C2C12細胞中miR-27a與骨骼肌胰島素抵抗之間的關聯。通過棕櫚酸酯處理的3T3-L1脂肪細胞制備的條件培養基孵育C2C12細胞來測定外泌體miR-27a介導的脂肪組織和骨骼肌之間的信號通訊。研究人員發現肥胖幼年小鼠血清miR-27a水平與肥胖和胰島素抵抗呈正相關，并且血清miR-27a水平與瘦素受體缺陷型db/db小鼠的胰島素抵抗和肥胖和胰島素抵抗相關，同時與高脂飲食喂養的C57BL/6J小鼠肥胖和胰島素抵抗相關。從高脂飲食喂養的C57BL/6J小鼠的脂肪細胞釋放的miR-27a與甘油三酯積累有關。來源于這些脂肪細胞的miR-27a通過miR-27a介導的對PPARγ及其下游基因的抑制來參與肥胖發展，在C2C12骨骼肌細胞中誘導胰島素抵抗。
技術路線
實驗結果
1、 血清中miR-27a水平與肥胖誘導的胰島素抵抗有關
圖一 血清miR-27a與肥胖兒童進行性全身胰島素抵抗有關，并且在高脂飲食喂養的小鼠和db / db（瘦素受體缺陷型）小鼠中血清miR-27a水平升高。
A) 肥胖（OB）和正常體重（NW）兒童的血清中的miR-27a水平，miR-27a在肥胖兒童的血清中升高；
B）血清miR-27a水平與BMI之間的相關性；
C）血清miR-27a水平與空腹血糖之間的相關性；
D）HF（高脂飲食）和LF（低脂飲食）喂養的小鼠2、4、8和12周時體脂肪分布百分比；
E）HF和LF組血清中miR-27a的相對表達；
F）HF組和LF組OGTT（口服葡萄糖耐量試驗）曲線下面積；
G）HF組和LF組ITT（胰島素耐量試驗）曲線下面積；
I）db / db小鼠的Lee’s指數顯著高于db / m小鼠；
J）db / db小鼠的空腹血糖顯著高于db / m小鼠；
K）db / db小鼠血清中miR-27a的相對表達顯著高于db / m小鼠；
L）db / m和db / db小鼠的OGTT曲線下面積。
圖二 在高脂飲食喂養的小鼠中，敲減miR-27a降低了血清miR-27a水平并且改善了葡萄糖和胰島素耐受性，但是不提高體脂肪百分比分布。
A）低脂飲食+空載體小鼠（LF + EV），高脂飲食+空載體小鼠（HF + EV）和高脂飲食+ miR-27a敲減小鼠的脂肪百分比；
B）各組血清miR-27a的相對表達，其中高脂飲食+空載體小鼠表達量最高；
C）各組OGTT曲線下面積，與LF+EV組相比，HF+EV和HF+miR-27a(-)都更高；
D）各組ITT曲線下面積，與HF+EV相比，HF+EV和HF+miR-27a(-)顯著升高。
2、 MiR-27a通過PPARγ抑制作用損害骨骼肌中的胰島素信號傳導
圖三 miR-27a促進骨骼肌中的胰島素抵抗。
A）第2、4、8、12周LF和HF小鼠骨骼肌中的miR-27a水平；
B）12周時LF和HF小鼠中IRS-1，Akt和GLUT4的mRNA表達；
C）12周時用胰島素處理（+）或未處理（-）的LF和HF小鼠骨骼肌中p-IRS-1，IRS-1，p-Akt，Akt和GAPDH的蛋白質表達；
D）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠骨骼肌中miR-27a水平；
E）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠中IRS-1，Akt和GLUT4的mRNA表達；
F）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠骨骼肌中p-IRS-1，IRS-1，p-Akt，Akt和GAPDH的蛋白質表達。
圖四 miR-27a通過靶向PPARγ來減少C2C12細胞中的葡萄糖消耗。
A）對照（黑色），miR-27a（+）（空白），miR-27a +羅格列酮（灰色）和羅格列酮（陰影）C2C12細胞中miR-27a的表達；
B）上述C2C12細胞中的葡萄糖消耗；
C）用（+）或不用（-）100nM胰島素溫育30分鐘的上述C2C12細胞中的葡萄糖攝取。與與對照相比，胰島素刺激未能增加miR-27a（+）細胞中的葡萄糖攝取；
D）通過預測靶掃描，mmu-miR-27a-3p和PPARγ3'UTR的318-325位的序列互補；
E）miR-27a和PPARγ的熒光素酶報道試驗結果顯示，miR-27a通過與野生型PPARγ3'UTR序列結合顯著降低熒光素酶密度，而突變型PPARγ3'UTR沒有發現減少。
圖五 miR-27a通過PPARγ抑制作用損害骨骼肌中胰島素介導的信號轉導。
A-C）PPARγ在12周LF和HF小鼠骨骼肌中的mRNA和蛋白質表達，與LF小鼠相比，HF小鼠骨骼肌中PPARγ的mRNA和蛋白質表達較低；
D-F）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠骨骼肌中PPARγ的mRNA和蛋白表達，HF小鼠中miR-27a敲減增加了PPARγ的mRNA和蛋白質表達；
G-J）羅格列酮治療部分增加過表達miR-27a的細胞中的PPARγmRNA和蛋白質表達；
K-L）羅格列酮治療增加了過表達miR-27a的細胞中胰島素刺激的p-IRS-1蛋白及其下游p-Akt蛋白表達。
3、 負載脂質的脂肪細胞（但不是巨噬細胞）會將miR-27a分泌到外泌體中
圖六 HF飲食喂養的小鼠的脂肪細胞釋放miR-27a，棕櫚酸酯處理的3T3-L1脂肪細胞分泌miR-27a。
A）LF和HF小鼠在2,4,8和12周的內臟脂肪組織中miR-27a的相對表達，與LF喂養的小鼠相比，喂食高脂肪飲食2周的小鼠的內臟脂肪組織中的MiR-27a表達增加；
B）db / m和db / db小鼠的內臟脂肪組織中miR-27a的相對表達，與db / m小鼠相比，db / db小鼠在內臟脂肪中表現出miR-27a的較低表達；
C）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠的內臟脂肪組織中的miR-27a水平，在喂食HF的小鼠中miR-27a敲減導致內臟脂肪組織中miR-27a水平降低；
D-F）與對照（Con）相比，在棕櫚酸鹽處理的細胞（Pal）中觀察到脂質積累的增加, TAG濃度也增加；
G）與對照相比，棕櫚酸酯處理的3T3-L1細胞中的miR-27a表達較低；
H）棕櫚酸鹽處理的細胞上清液中miR-27a水平比對照細胞高2.7倍。
圖七 負載脂質的脂肪細胞衍生的miR-27a在外泌體中分泌。
A）在2,4,8和12周的LF和HF小鼠的血清中的FABP4濃度；
B -C）與LF小鼠相比，血清外泌體為FABP4陽性，并且來自HF小鼠血清的這些外泌體中的miR-27a積累較高；
D）從對照或棕櫚酸處理的表達miR-27a的3T3-L1細胞上清液中提取的外泌體中的MiR-27a水平。與對照相比，用棕櫚酸酯處理3T3-L1細胞將miR-27a釋放到上清液中；
E）在用棕櫚酸鹽處理的過表達miR-27a的3T3-L1細胞的上清液中，miR-27a與FABP4共定位；
F）在不存在或存在0.3mM棕櫚酸酯的情況下溫育48小時的來自3T3細胞的外泌體的掃描電子顯微照片；
G）外泌體標記物CD63存在上述細胞中；
H）上述細胞外泌體中miR-27a的表達，棕櫚酸酯處理后表達增強。
4、 脂肪細胞衍生的外泌體miR-27a被C2C12骨骼肌細胞攝取
圖八 C2C12細胞攝取脂肪細胞分泌的外泌體miR-27a。
A）與LF小鼠相比，HF的骨骼肌裂解物中FABP4蛋白的表達增加；
B）在C2C12細胞與CM1（對照）或CM2（棕櫚酸酯處理）培養基孵育48小時后，上清液中的FABP4降低；
C）與CM1或CM2孵育后C2C12細胞中的FABP4濃度；
D）在C2C12細胞與CM1或CM2培養基孵育48小時后，上清液中miR-27a水平降低；
E）在用對照或棕櫚酸處理的3T3-L1細胞（其中miR-27a被敲除）制備的條件培養基中，與CM1相比，CM2孵育的C2C12細胞中miR-27a水平升高；
F）與對照相比，用棕櫚酸酯處理的脂肪細胞的上清液孵育的C2C12中的熒光強度更大。
5、 脂肪細胞衍生的miR-27a在骨骼肌細胞中積累，并且通過阻抑PPARγ而損害胰島素信號傳導
圖九 脂肪細胞衍生的miR-27a增加miR-27a，并且損害C2C12細胞中的胰島素信號傳導。
A-B）與CM1處理的細胞相比，CM2處理的C2C12細胞的葡萄糖消耗，葡萄糖攝取和胰島素刺激的葡萄糖攝取降低；
C-D）與CM1組相比，CM2組中觀察到PPARγmRNA和蛋白質水平的明顯降低，CM1組通過CM2組中的miR-27a敲減而恢復；
E-F）與CM1處理的細胞相比，CM2處理的C2C12細胞中PPARγ，IRS-1和GLUT4mRNA表達降低，并且胰島素刺激的p-IRS-1和p-AKT降低。
結論
綜上所述，這些結果確定了脂肪組織和骨骼肌之間在胰島素抵抗發展過程中的新型交叉通訊信號通路，并且表明脂肪組織來源的miR-27a可能在肥胖引發的骨骼肌胰島素抵抗發生中起關鍵作用。