Cancer research：

ERβ介導的circATP2B1和miR-204-3p信號軸促進透明細胞腎細胞癌侵襲

研究表明，雌激素受體β（ERβ）可影響透明細胞腎細胞癌（ccRCC）的進展。 然而，ERβ調節ccRCC進展的詳細機制仍有待進一步闡明。近日，河北醫科大學第二附屬醫院王曉路院長團隊發表在《Cancer Research》 (IF=9.122)上的文章《ERβ-mediated alteration of circATP2B1 and miR-204-3p signaling promotes invasion of clear cell renal cell carcinoma》報告了ERβ介導的ccRCC進展的機制細節。他們發現，ERβ通過抑制circATP2B1的表達及通過直接結合其宿主基因ATP2B1的啟動子區域增加ccRCC細胞侵襲。ERβ抑制circATP2B1表達導致miR-204-3p表達降低，纖連蛋白1（FN1）表達升高，進一步增強ccRCC細胞侵襲。在ccRCC小鼠模型中用shRNA靶向抑制ERβ或過表達circATP2B1可以部分逆轉這一增強作用。作者還通過TCGA數據庫中ccRCC患者生存數據表明，ERβ和FN1高表達患者的總體生存率更差，而miR-204-3p高表達患者的總體生存率更高。以上研究結果表明ERβ通過改變ERβ/ circATP2B1 / miR-204-3p / FN1軸的表達促進ccRCC細胞侵襲。

技術路線：

研究結果：

1. ERβ 促進ccRCC細胞侵襲

圖1（A）Western blot方法驗證786-O細胞中敲低的ERβ（左）和A498細胞中ERβ的過表達（右）。（B）使用ERβ-shRNA和pLKO轉染的786-O細胞（左2張圖像）和用ERβ-cDNA和pWPI轉染的A498細胞進行腔室 - transwell侵襲測定。（C）使用ERβ-shRNA和pLKO轉染的786-O細胞（左2張圖像）和用ERβ-cDNA和pWPI轉染的A498細胞進行3D侵襲實驗。

2. 高表達的ERβ與ccRC預后差相關

圖2（A）基于TCGA數據庫的分析表明較高水平的ERβ與較差的存活率有關。（B-C）生存曲線顯示較高水平的ERβ與男性及女性RCC患者的生存率較低相關。（D）總生存率在男性和女性RCC患者中無顯著性差異。（E）基于TCGA數據庫的T分期分析顯示，RCC組織高ERβ水平與更高的癌癥分期相關。

3. ERβ通過調節circATP2B1表達增強RCC細胞侵襲

圖3（A）在敲減ERβ(shERβ)及空載對照(pLKO)的786-O細胞以及過表達ERβ及空載對照(pWPI)的A498細胞中采用Real-time PCR篩選一組與ccRCC相關的circRNAs。（B）Western blot在786-O細胞及Caki-1細胞驗證shERβ#1及shERβ#2的敲減效果。（C）轉染或未轉染shERβ#1/shcircATP2B1#1或shERβ#2/shcircATP2B1#2的786-O細胞的腔室 - transwell侵襲實驗。（D）轉染pLKO+pLVTHM, shERβ#2+pLVTHM, pLKO+shcircATP2B1#2, 或 shERβ#2+shcircATP2B1#2的Caki-1細胞的腔室-transwell侵襲實驗。（E）過表達ERβ (oeERβ)或過表達circATP2B1（oecircATP2B1）的A498細胞的腔室-侵襲實驗。

4. ERβ調節circATP2B1表達的機制解讀

圖4 （A）在ATP2B1上游2kb啟動子區域存在一個雌激素響應元件（ERE）。（B）ChiP pull-down驗證ERβ可以與推測的ERE結合。（C）lncRNA Hotair 啟動子ERE作為陽性對照，以及距APT2B1 ERE上游約500bp的（-2268nt 到-2254nt）區間作為陰性對照做ChiP分析。（D-F）雙熒光素酶報告基因實驗驗證ATP2B1啟動子ERE與ERβ的結合。

5. ERβ通過改變circATP2B1 / miR-204-3p增強RCC細胞侵襲

圖5（A）qPCR檢測在A498細胞中敲除或過表達ERβ或circATP2B1后，miRNA的表達變化。（B）RNA pull-down分析檢測circATP2B1與miRNA的結合。（C）786-O挽救實驗結果顯示sh-circATP2B1可以逆轉ERβ敲減后引起的miR-204-3p的表達水平升高。（D）挽救實驗結果顯示oecircATP2B1可以逆轉ERβ過表達后引起的miR-204-3p的表達水平降低。（E）circATP2B1影響miRNA-204-3p的穩定性。（F）腔室-transwell侵襲實驗和3D侵襲實驗分析786-O細胞轉染pLKO+Ctl, shERβ#1+Ctl, pLKO+miR-204-3p inhibitor, 或shERβ#1+miR-204-3p inhibitor后的細胞侵襲情況.（G）腔室-transwell侵襲實驗和3D侵襲實驗分析轉染pWPI+pLVTHM, oeERβ+pLVTHM, pWPI+oemiR-204-3p, oeERβ+oemiR-204-3p后A498細胞的侵襲情況。

6. ERβ-circATP2B1-miR204-3p通過改變FN1信號促進ccRCC侵襲

圖6（A）qRT-PCR分析篩選786-O細胞中與ccRCC轉移相關基因。（B）qRT-PCR分析篩選A498細胞中與ccRCC轉移相關基因。（C）圖表展示FN1可能是受ERβ、circATP2B1和miR-204-3p調控的RCC轉移相關的基因。（D）ERβ可以上調786-O和A498細胞中FN1的表達。（E）Western blot分析分別轉染pLKO+pLVTHM, shERβ#1+pLVTHM, pLKO+shcircATP2B1#1, 或 shERβ#1+shcircATP2B1#1的786-O細胞及轉染pWPI+pWPI, oeERβ+pWPI, pWPI+oecircATP2B1, or oeERβ+oecircATP2B1的A498細胞的FN1的表達水平。（F）Western blot分析分別轉染pLKO+Ctrl, shERβ#1+Ctrl, pLKO+miR-204-3p inhibitor, 或 shERβ#1+miR-204-3p inhibitor的786-O細胞及轉染pWPI+pLVTHM, oeERβ+pLVTHM, pWPI+oemiR-204-3p, or oeERβ+oemiR-204-3p的A498細胞的FN1的表達水平。（G）腔室-transwell分析及3D侵襲實驗分析786-O細胞轉染pWPI+pLVTHM, oeERβ+pLVTHM, pWPI+shFN1, oe ERβ +shFN1后細胞侵襲情況。（H-J）數據庫預測的FN1 3’UTR與miR-204-3p靶向結合并通過雙熒光素酶報告基因驗證。(K) 生存曲線驗證高表達miR-204-3p的ccRCC患者總生存期較長。（L）具有高表達FN1的RCC患者預后較差。

7. 體內小鼠研究證實ERβ通過調節circATP2B1促進RCC轉移

圖7 （A）IVIS圖像分析發現小鼠原位腫瘤模型出現遠端轉移。（B-E）肝、小腸、脾和左腎發現轉移。（F）轉移定量。（G）轉移點定量。（H）IHC染色分析ERβ和FN1的表達。